Аффинные лиганды концентрация

Однако кажущаяся простота метода и отсутствие у новичка представления о возможных трудностях, сопровождающих его применение на практике, могут привести к обескураживающим неудачам. Действительно, трудно заранее предугадать, какой аффинный лиганд полезнее выбрать — с высоким или низким сродством, какова наиболее благоприятная концентрация этого лиганда в сорбенте, какую роль должна играть матрица, какие носители подходят и какие не подходят для иммобилизации аффинного лиганда. Например, отлично зарекомендовавшие себя с точки зрения иммобилизации ферментов носители на основе кремнезема оказываются в ряде случаев совершенно непригодными для использования в аффинной хроматографии из-за высокой неспецифической сорбции. [c.5]

Для того чтобы из уравнения (3.2) вывести другие зависимости, Грейвс и Ву [3] сделали следующие допущения. Объем геля V включает меньший объем V раствора внутри сетки, построенной полимерными молекулами геля. Перед добавлением раствора фермента концентрация аффинного лиганда, связанного в геле, равна 0 (в молях на объем и), а концентрация фермента равна [c.22]

Разновидность количественной аффинной хроматографии — фронтальный анализ [10] он основан на понятии плотности о аффинного лиганда на единицу длины колонки с агарозой. Если / — общая длина колонки с агарозой, а Li — общее количество им мобилизованного лиганда в сорбенте, то о = - г/ - Если аффинный сорбент характеризуется слабым сродством, то раствор фермента в концентрации [ 0] наносится на колонку непрерывно, а для элюирования фермента с колонки необходим объем V. Можно написать следующее уравнение [c.51]

ВЫСОКОЙ концентрацией аффинного лиганда является слишком сильное взаимодействие с выделяемым вешеством, что затрудняет его элюирование. Так, например, тщательный контроль концентрации лиганда имеет решающее значение для выделения глюкокиназы на агарозе со связанной N-(6-аминогексил)-2-амино-2-дез-оксн-D-глюкопиранозой [14] (рис. 5.6). [c.81]

Адсорбция белка как функция концентрации аффинного лиганда [c.155]

Изучение влияния концентрации е-амино-капроновой кислоты на ее связывание активированной бромцианом сефарозой показало, что высокая концентрация аффинного лиганда при коротком времени инкубации дает лучшие результаты, чем низкая концентрация при продолжительной инкубации. [c.192]

Для успешного проведения аффинной хроматографии необходимо не только связывание аффинного лиганда, но и полное удаление всего аффинного лиганда, нековалентно связанного с носителем. Поэтому соединения следует тщательно промывать, контролируя результаты промывки. Сорбированные ароматические соединения можно успешно удалить с помощью органических растворителей, а для удаления белков полезна промывка денатурирующими агентами, если они не влияют на носитель и на связывающую способность аффинного лиганда. Необходимо быть уверенным в том, что измеряемая биологическая активность специфического адсорбента действительно обусловлена только ковалентно связанным аффинным лигандом. С этой целью определяют изменение концентрации нерастворимого производного после инкубирования в различных буферных растворах или после других подходящих обработок сорбента. [c.12]

Количество связанного лиганда определяется в зависимости от его природы с помощью методов, основанных, как правило, на освобождении аффинного лиганда в результате щелочного или кислотного гидролиза. Анализируя пептиды, удобнее всего определять количество аминокислот после кислотного гидролиза [3]. При использовании радиоактивного лиганда целесообразно проводить измерение радиоактивности. Концентрацию связанного аффинного лиганда удобнее выражать числом микромолей этого лиганда, приходящимся на 1 мл набухшего в колонке геля, а не на 1 г сухого носителя. [c.12]

Впервые влияние концентрации лиганда на связывание ферментов с аффинными лигандами было исследовано в работе Харвея с сотр. [5], где было изучено поведение различных ферментов по отношению к иммобилизованному аденозин-5 -моно-фосфату (5 -АМР). [c.104]

Концентрация лиганда может быть использована для тонкого регулирования связывания макромолекулы с аффинной колонкой. Концентрация лиганда, выбранная на основании отдельного эксперимента, вероятнее всего, не будет оптимальной для достижения наилучшего разделения. Это особенно относится к адсорбентам, содержащим фенилборную кислоту. В этих случаях должны быть поставлены несколько экспериментов с различными концентрациями лиганда для окончательного решения вопроса об условиях разделения. [c.104]

В этом разделе описываются этапы аффинной элюции. Образец уравновешивают в соответствующем буфере и наносят на ионообменную колонку, заполненную, например, КМ-целлюлозой. Нужный фермент полностью адсорбируется колонку с нанесенным образцом промывают небольшим количеством исходного буфера. Если эффект аффинной элюции значителен, то pH исходного буфера может быть тем же, что и pH буфера для элюции. Однако чаще pH в колонке повышают до соответствующего значения, при ротором нужный фермент только начинает двигаться, например когда а = 0,95—0,90 (рис. 4,23 и 4.24). Затем на колонку наносят раствор лиганда, концентрация которого должна превышать по величине константу диссоциации-комплекса фермент — лиганд, и если фермента много, то общее количество лиганда, выраженное в молях, должно быть больше количества (в молях) центров связывания. С другой стороны,, концентрация лиганда не должна существенно изменять ионную-силу буфера. Максимальное количество используемого лиганда часто определяется соображениями стоимости, но если константа диссоциации его комплекса с белком достаточно высока и требуемые концентрации лиганда приводят к повышению ион-ной силы буфера, то может потребоваться введение стадии вымывания подставным лигандом . В этом случае на этапе, предшествующем элюции, используют соединение, имеющее.л от же заряд, что -И лиганд, но не связывающееся с ферментом. Все-белки, которые выходят из колонки при повышении ионной си- [c.139]

Хотя многие выведенные соотношения должны быть уточнены экспериментально, они уже сегодня полезны, поскольку указывают на аспекты, требующие от исследователя внимания. Аффинный сорбент с концентрацией связанного лиганда —Ю ммоль/л следует использовать только для выделения веществ, константы равновесия которых (с закрепленным аффинантом) 10 моль/л. Для систем с более высокими (менее благоприятными) константами равновесия следует использовать сорбенты с соответственно более высоким содержанием связанного аффинного лиганда. Однако на практике этому случаю сопутствуют многочисленные ограничения, которые рассматриваются в гл. 5. [c.34]

Объем элюирования макромолекулярного вещества прямо пропорционален концентрации аффинного лиганда, связанного с нерастворимым носителем, если концентрация растворимого аффинного лиганда постоянна. Кроме того, он обратно пропорционален концентрации растворимого аффинанта, если концентрация иммобилизованного аффинанта постоянна. Эти зависимости выражаются уравнением [c.45]

МНг-сфероне проводилась в оптимальных условиях, взятых из данных, приведенных на рис. 3.1. Для элюирования использовались растворы антилпзина в различных концентрациях. Концентрация иммобилизованного аффинного лиганда [L], определенная исходя из эффективной емкости колонки, составила 2,6-10 моль/л. Свободный объем V-m, найденный с помощью декстрана 2000, равен 2,1 мл. Константа диссоциации комплекса химотрипсина с [c.50]

Теоретически выведенная взаимосвязь между количеством сорбируемого фермента, концентрацией аффинного лиганда и константами равновесия лиганд — фермент рассмотрена в гл. 3. Из рис. 3.3 следует, что для систем с низким сродством Кь = = 10 2 моль/л) концентрация привязанного аффинного лиганда представляет собой критический параметр для получения эффективного сорбента. На рис. 5.6 показана аффинная хроматография глюкокиназы на 2-амино-2-дезокси-о-глюкопиранозо-N-(6-амино-гексаноил) —сефарозе при четырех концентрациях связанного аффинанта [15]. Видно, что оптимальная концентрация аффинного лиганда равна 3,75 мкмоль/г (рис. 5.6,6) при более низких концентрациях фермент не отделяется от неактивного материала, в то время как при более высоких концентрациях необходимо увеличить концентрацию глюкозы в элюате и при этом глюкокиназа выходит в большем объеме элюата. При концентрации 10 мкмоль/г глюкокиназа не может быть элюирована даже при высоких концентрациях глюкозы она может быть снята только пропусканием 0,5 М хлорида калия. [c.75]

Другим примером влияния концентрации аффинного лиганда является аффинная хроматография смеси лактатдегидрогеназы и сывороточного альбумина на N -(6-аминогексил)-5 -АМР — сефарозе [8]. При высоких концентрациях лиганда (1,5 мкмоль 5 -АМР в 1 мл) для элюирования с )ермента необходимо введение NADH ( удар ). При низких концентрациях (0,125 мкмоль 5 -АМР в 1 мл) десорбция фермента достигается просто градиентом концентрации (от О до 1 моль/л) хлорида калия. Дальнейшее уменьшение количества прикрепленного лиганда (0,025 мкмоль 5 -АМР в 1 мл) приводит к прогрессивному увеличению доли лактатдегидрогеназы, элюируемой исходным уравновешивающим буфером даже перед наложением линейного градиента солей. В то же время [c.75]

Рис. 5.8. Связываемость малатдегидрогеназы (1), лактатдегидрогеназы из мышцы сердца свиньи (2) и глицерокиназы (3) на N -(6-аминогексил)-5 -АМР—сефарозе в зависимости от концентрации аффинного лиганда [8].

Геометрия колонок, концентрация и общее содержание аффинного лиганда — вот три основных параметра, которые определяют и связываемость, и емкость носителя. Для систем с высокой аффинностью высота колонки с аффинным сорбентом, содержащим высокие концентрации лиганда, мало влияет связываемость зависит от концентрации аффинанта, а не от высоты колонки. Это имеет практическое значение колонки, содержащие высокие концентрации лиганда, можно использовать для концентрирования разбавленных растворов ферментов. Кроме того, в системах с высокой аффинностью, в которых элюирование адсорбированных макромолекул без денатурации затруднено, разбавление аффинного сорбента немодифицированным гелем или уменьшение концентрации лиганда может способствовать элюированию в более мягких условиях. В некоторых случаях, конечно, фермент различает только концентрацию лиганда в гранулах модифицированного геля, которая, однако, не меняется при разбавлении. В таких случаях трудности элюирования остаются даже после разбавления геля [11]. Для взаимодействий систем с низкой аффинностью очень важна геометрия колонки. Для разделения специфически адсорбированных белков от неадсорбированных наиболее выгодно использовать длинные колонки, а не короткие. [c.80]

В колоночной аффинной хроматографии достаточно сильное взаимодействие выделяемых веществ с иммобилизованным аффинным лигандом приводит к концентрированию вещества и его медленной миграции вниз по колонке. Этот процесс зависит от концентрации лиганда и почти не зависит от начальной концентрации свободных макромолекул. Например, в аффинной хроматографии глицерокиназы или лактатдегидрогеназы на К -(6-аминогексил)-5 -АМР— сефарозе не наблюдалось влияния концентрации фермента на емкость, если концентрации ферментов прямо пропорциональны концентрациям нуклеотида или зависимость между ними близка к таковой [21]. Необходимые при этом требования заключаются в том, что комплементарные макромолекулы следует наносить на колонку в ненасыщающих количествах, а также подбирать скорость потока раствора [19]. [c.82]

Ограниченная диффузия возникает, если молекулярная диффузия в порах матрицы затруднена из-за экранирования подхода макромолекул к прикрепленному аффинному лиганду. Экспериментально вклад этой диффузии можно определить с большим трудом, но для аффинной хроматографии на очень пористых носителях эти трудности становятся минимальными. На практике для достижения равновесных условий желательно, чтобы скорость потока была по возможности низкой. Например, при скорости потока 400 мл/ч для выделения стафилококковой нуклеазы на колонке объемом 20 мл небольшие количества нуклеазы появлялись в первом пике вместе с белковыми примесями, особенно если общая концентрация белков в образце была высока (20—30 мг/мл) [5]. Однако даже при такой высокой скорости потока нуклеаза полностью сорбировалась, если наносился менее концентрированный образец. Зависимость связывания лактатдегидрогеназы на №-(6-аминогексил)-5 -АМР — сефарозе от скорости потока пссле-дована Лоу и др. [21]. Было найдено, что увеличение скорости потока относительно мало влияет на сорбцию. При высоких скоростях потока эффективность колонки (ВЭТТ), а также связываемость р уменьшаются. Влияние скорости потока более заметно в небольших колонках, с которых часть белка с ферментативной активностью элюируется со свободным объемом. Влияния концентрации инертного белка (бычьего сывороточного альбумина) при высоких скоростях потока (67 мл/ч) также не обнаружено. [c.84]

Бесконкурентное действие. Если устойчивость тройного комплекса ЕЫ выше, чем двойного Е1, то присутствие свободного ингибитора I уменьшает долю фермента в подвижной фазе и повышает связываемость фермента. Если тройной комплекс ЕЫ менее устойчив, чем двойной ЕЬ, увеличение концентрации свободного аффинного лиганда приведет к элюированию фермента. [c.92]

В разд. 5.3 детально обсуждалось влияние концентрации иммобилизованных аффинных лигандов. Очевидно, что после присоединения аффинного лиганда к инертному носител10 перед сорбцией очень полезно определить долю молекул, ковалентно присоединившихся к матрице. Подготовленный аффинный гель не должен содержать реакционноспособных групп (о блокировании остаю- [c.243]

Изучение оптимальных условий сорбции предполагает, что аффинный лиганд присоединен к нерастворимому носителю с достаточно высокой пористостью и на достаточном расстоянии от его поверхности (разд. 5.1), чтобы сохранить даже после присоединения высокое сродство к выделяемому веществу (разд. 5.2). Емкость специфического сорбента определяется концентрацией доступных аффинных лигандов и их константами диссоциации пз комплекса с выделяемым веществом (рис. 3.3). В разд. 5.3 ул<е обсуждалась оптимальная концентрация им.мобнлизованного аффинного лиганда, которая должна была бы обеспечить достаточную емкость и одновременно позволить освобождаться выделяемому веществу из специфического комплекса с иммобилизованным аффинантом в достаточно мягких условиях, не приводя, однако, к неспецифической сорбции. Свойства пространственной группы, вводимой между аффинным лигандом и поверхностью нераство-рихмой матрицы [6], могут оказывать влияние на свойства сорбента, как и концентрация аффинного лиганда. Специфический сорбент должен быть приготовлен таким способом, чтобы все группы, способные к присоединению, были блокированы (разд. 8.4) и чтобы число групп, способных принимать участие в неспецифической сорбции, было минимальным (разд. 10.3). Однако особенно важно, чтобы все молекулы аффинного лиганда, которые не присоединились к носителю ковалентной связью, были тщательно отмыты (разд. 8.6). [c.258]

Специфический комплекс выделяемых веществ с иммобилизованным аффинным лигандом может распадаться в результате пространственного модифицирования, напрпмер, мочевиной, солями гуанидина или хаотропными ионами. Эти реагенты разрушают водородные связи или изменяют структуру воды вблизи гидрофобных областей. При использовапии этих реагентов следует помнить, что компоненты комплекса могут быть необратимо разрушены при выделении. Однако известно, главным образом для иммобилизованных ферментов, что присоединение белков к нерастворимым носителям приводит к повышению стабильности. Подбирая концентрацию, температуру и время обработки, можно конформационные изменения адсорбционных участков ири десорбции уменьшить до минимальных то же самое относится и к обратимым конформаци-онным изменениям молекул в целом как выделяемых веществ, так и иммобилизованных аффинных лигандов. На практике следует предварительно найти минимальную концентрацию, необходимую [c.270]

В качестве аффинных лигандов можно использовать любые соединения, прочно, специфично и обратимо связывающиеся с выделяемым веществом. Химическое строение аффинных лигандов может быть самым различным. Поскольку в настоящее время метод аффинной хроматографии применяется главным образом для выделения ферментов и их ингибиторов [89J, мы рассмотрим примеры, взятые из этой области. Как уже упоминалось, при выделении фермента аффинными лигандам1И могут служить его ингибитор, аналогичный субстрату, а также эффектор, кофактор и в отдельных случаях даже субстрат. Это справедливо и для фермента, требующего длл реакции два субстрата, но способного достаточно сильно связываться только с одним из них. Субстрат также можно использовать для адсорбции фермента в таких условиях, когда фермент связывается, но сам не способен катализировать реакцию (например, в отсутствие ионов металлов, необходимых для реакции), а также когда константа Михаэлиса зависит от pH или температуры. Аффинный адсорбент для выделения белков обычно трудно получить из аффинного лиганда, если константа диссоциации его комплекса с белком превышает (0,5—1,0)-Ю [16]. Однако Стире и сотр. [84] показали, что очень эффективный адсорбент для р-галактозидазы можно получить даже из такого относительно слабого ингибитора, как н-аминофенил-р-о-тиогалактопирано-зид (/i , 5-10 ). Этого удается достигнуть, повышая концентрацию нерастворимого аффинного лиганда и увеличивая расстояние между аффинным лигандом и матрицей носителя, что приводит к максимальной доступности аффинного лиганда, для белка в растворе. [c.9]

В качестве примера связывания аффинного лиганда рассмотрим получение нерастворимого производного химотрипсина [50]. Раствор (140 мл) химотрипсина (20 мг/мл) и 60 мл 0,5М боратного буфера (pH 8,7) прибавляют к 100 мл аминохлор-сылш-триазинового производного сефарозы и выдерживают смесь 18 ч при постоянном перемешивании при 23 °С. Продукт промывают смесью 5М хлорида натрия и 8М мочевины (1 1 по объему). Изучение зависимости количества связанного химотрипсина от концентрации фермента показало, что при концентрации химотрипсина 4 мг на 1 мл реакционной смеси с сефарозой связывается более 60% химотрипсина, а при концентрации 8 мг/мл количество связанного белка превышает 70%. В отдельных экспериментах концентрация боратного буфера в реакционной смеси менялась в пределах 0,07—0,2М. [c.18]

Продукт промывают 6,0 М раствором хлорогидрата гуанидина и водой, сушат для анализа до постоянной массы при 105 °С и помещают в соответствующий буфер для аффинной хроматографии. (При первоначальной концентрации трипепти-да в растворе 0,02, 0,04, 0,12 и 0,25 моль/л высушенный продукт содержит соответственно 0,85, 1,2, 2,5 и 4,5 мкмоль аффинного лиганда/г.) [c.187]

При изучении взаимодействий белок — лиганд методом аффинной хроматографии концентрация белка ша составляет обычно <20 мкмоль (для белка с молекулярной массой 5000— 1 мг/мл). Соответственно для исследований, требующих более милимолярной суммарной концентрации лиганда, использование ms вместо ms в выражениях, приведенных в табл. 1 ji 2, не приводит к ошибке, поскольку соблюдается требование > 7гл. Однако, если ms и тл имеют сравнимые значения, необходимо различать параметры fus и ms и использовать последний параметр для количественной оценки аффинной хроматографии. [c.202]

Смотреть страницы где упоминается термин Аффинные лиганды концентрация: [c.18] [c.45] [c.66] [c.76] [c.79] [c.85] [c.106] [c.164] [c.164] [c.190] [c.246] [c.261] [c.262] [c.265] [c.373] [c.446] [c.448] [c.9] [c.10] [c.11] [c.35]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология