Аффинные лиганды связывание на сорбенте

Хотя синтез аффинного сорбента с индивидуальной специфичностью при наличии одной из продажных активированных матриц и не представляет особого труда, он все же требует наличия достаточного количества очищенного аффинного лиганда, не инактивирующегося в условиях его посадки на матрицу. Заметим, что после посадки лиганда на матрицу прочность связывания с ним биоспецифического партнера может сильно уменьшиться по сравнению с тем уровнем, который наблюдался при образовании их свободного комплекса в растворе (иной раз константа диссоциации комплекса на сорбенте может оказаться на три порядка выше, чем в растворе). Это обстоятельство играет важную роль при осуществлении конкурентной аффинной элюции вещества с сорбента с использованием свободного лиганда (см. ниже). Тем не менее прочность аффинного связывания в большинстве случаев оказывается достаточной для удержания нужного вещества на матрице в условиях отмывки с нее всех сопутствующих ему примесей. Нередко прочность комплекса вещества с аффинным лигандом увеличивается, если последний имеет некоторую свободу ориентирования в пространстве, т. е. закреплен на матрице с помощью спейсера. [c.362]

Иммобилизация аффинных лигандов на сополимере этилена и малеинового ангидрида (ЭМА) рассмотрена в обзоре Гольдштейна [23]. Метод связывания ферментов на таком сорбенте разработан Левиным и др. [40]. Белок присоединяется к ангидридным группам полимера своими аминогруппами [c.199]

Когда аффинный лиганд привязан к матрице (например, в 0,2 М К-фосфатном буфере, pH 7,5), карбоксильные группы освобождаются (либо в результате связывания с белком, либо из-за гидролиза в водной среде), и они придают сорбенту полианионные свойства. [c.200]

Для успешного проведения аффинной хроматографии необходимо не только связывание аффинного лиганда, но и полное удаление всего аффинного лиганда, нековалентно связанного с носителем. Поэтому соединения следует тщательно промывать, контролируя результаты промывки. Сорбированные ароматические соединения можно успешно удалить с помощью органических растворителей, а для удаления белков полезна промывка денатурирующими агентами, если они не влияют на носитель и на связывающую способность аффинного лиганда. Необходимо быть уверенным в том, что измеряемая биологическая активность специфического адсорбента действительно обусловлена только ковалентно связанным аффинным лигандом. С этой целью определяют изменение концентрации нерастворимого производного после инкубирования в различных буферных растворах или после других подходящих обработок сорбента. [c.12]

Избирательное связывание лигандов с носителями для получения аффинных сорбентов [c.186]

Аффинная хроматография [27—31] представляет собой один из наиболее специфических методов выделения реакционноспособных соединений, в частности ферментов, и даже таких надмолекулярных агрегатов, как вирусы. Сорбентом в этом случае служит гель типа агарозы, к которому ковалентно присоединен подходящий лиганд, например субстрат фермента. Когда раствор, содержащий выделяемое вещество (скажем, фермент), пропускают через колонку с соответствующим образом приготовленным сорбентом, взаимодействие этого вещества с закрепленным на сорбенте лигандом (в данном случае фермента с субстратом) приводит к его удерживанию и, следовательно, к концентрированию. Поскольку сорбция носит обратимый характер, это вещество можно затем элюировать с колонки. Один из вариантов этого приема, который, строго говоря, уже не относится к области хроматографии, заключается в том, что иммобилизованный на геле фермент служит для непрерывного превращения растворенного в подвижной фазе субстрата. Разделение по методу аффинной хроматографии может быть основано на различного рода специфических взаимодействиях, таких, как связывание фермента с ингибитором, гормона с рецептором, антигена с антителом, а также гибридизация полинуклеотидов. Этот метод позволяет выделять даже целые клетки. [c.21]

Эти соображения в определенно степен сохраняют свою силу и при использовании низкомолекулярных лигандов, если в ходе аффинной хроматографии на них будут сорбироваться белки. Разумеется, ситуация здесь лучше, так как на поверхности белка может быть лишь небольшое число аффинных центров связывания, а действующие здесь силы уступают ковалентным связям, поэтому денатурации белка при посадке на аффинный сорбент опасаться не приходится (мы сейчас оставляем в стороне возможность связыва- [c.386]

Отсюда следует важный практический вывод для полноты связывания необходимо выполнение условия [L] К . При выборе концентрации лиганда в сорбенте надо опираться на значение константы диссоциации аффинного комплекса. Здесь следует проявлять осторожность в отнотиении использования значений Къ, известных из взаимодействия аффинных пар в растворе их сродство на сорбенте, как уже упоминалось, может быть слабее, а значение — соответственно больше. Тем не менее для оценки порядка величии эти цифры использовать можно. [c.400]

Таким образом, чем сильнее взаимодействие субстрата и ингибитора с ферментом, тем выше комплементарность связываю-ших участков. Это справедливо не только в отношении пространственного расположения, но также и в отношении природы комп-лементирующих частей молекул. Однако способы привязки аффинного лиганда к нерастворимому носителю в значительной степени ограничены, потому что лиганд должен быть привязан той частью молекулы, которая не принимает участия в связывании. Кроме того, иммобилизация аффинанта не должна приводить к изменению его конформации или отрицательно влиять на природу его связывающих участков. Эффективность аффинного сорбента зависит от степени, до которой эти требования выполняются. [c.73]

В этот обзор включены также аффинные лиганды с очень узкой специфичностью. Например, если к носителю прикрепить ингибитор, специфичный для единственного фермента, образующийся сорбент также будет специфичен только для данного фермента. Однако для использования специфических лигандов необходимо проводить различные и часто очень трудоемкие синтезы сорбента для каждого разделения. Не все аффинанты, которые подходят для комплементарного связывания макромолекул, имеют также подходящие функциональные группы для их прикрепления к нерастворимому носителю. Эти группы долл ны быть предварительно введены в аффинный лиганд, так же как и подходящей длины пространственная ножка , необходихмая главным образом для низкомолекулярных аффинных лигандов (она позволяет осуществлять их специфические взаимодействия с сорбируемым веществом). Практическая полезность специфических сорбентов возрастает, если для их приготовления вместо узко специфических лигандов использо-вать так называемый общий лиганд [37]. Очевидно, что матрица с групповой специфичностью, содержащая общий лиганд, проявляет аффинность к большой группе биологических макромолекул. Например, ферменты метаболизма аспарагиновой кислоты обнаруживают групповую специфическую [c.104]

Для упорядоченного механизма иммобилизация лиганда А подвержена обычным ограничениям аффинной хроматографии. Б этом случае иммобилизация лиганда В не приводит к конкурентному сорбенту для комплементарной молекулы исключение составляют случаи, когда лиганд А присутствует в рабочем буферном растворе, в котором наносят фермент на колонку. Таким образом, присутствие лиганда А является необходимым для связывания сорбентом ферментов, поскольку лиганд В связывает двойной комплекс лиганд А — фермент. Это позволяет ввести в хроматографию предварительный отбор — из бирательное связывание, последующее элюирование достигается удалением лиганда А из рабочего буферного раствора. [c.110]

Избирательное выделение биологически активных макромолекул аффинной хроматографией основано на обратимых взаимодействиях между имхмо билизованным аффинным лигандом и свободной макромолекулой. Однако принцип аффинной хроматографии может быть также использован даже с сорбентом, который содержит необратимый ингибитор, когда после сорбции комплементарной макромолекулы в специфическом комплексе образуется ковалентная связь. Для освобождения выделяемого вещества из комплекса с аффинным сор бентом используют подходящую химическую реакцию. Пример ковалентной аффинной хроматографии— выделение ацетилхолинэстеразы с помощью иммобилизованных органофосфатов [1, 56]. Ацетилхолинэстераза принадлежит сериновым эстеразам, для которых типично ингибирование связыванием с органофосфатами или органофосфонатными эфирами, содержащими легко отщепляемую группу, например, [c.158]

Другим методом аффинной хроматографии, использующим образование специфического комплекса макромолекулы выделяемого вещества с аффинным лигандом, является биоспецифическое элюирование с неспецифических сорбентов этот метод известен как аффинное элюирование и в некоторых случаях как специфическое элюирование субстратом [54]. В основе метода лежит неспецифичеакое связывание, например, слмеси ферментов полимером, который несет на себе функциональные группы, взаимодействующие с ферментами. Требуемый фермент затем специфически элюируют растворол субстрата, ингибитора или какого-либо другого аффинного лиганда. [c.160]

Из вышеизложенного следует, что кроме природы нерастворимого носителя существенную роль играет также метод связывания. В табл. 8.12 дан обзор методов связывания, рассмотренных в разд. 8.2 и 8.3. При выборе методов связывания главное внимание уделяется тому, какие группы аффинного лиганда можно использовать для присоединения к нерастворимой матрице без затрагивания связывающих участков аффинных лигандов. Если доступно несколько групп, рекомендуется выбрать наиболее избирательный метод, потому что желательна специфическая связь через одну определенную функциональную группу. Присоединение не должно приводить к появлению в специфическом сорбенте неспецифически сорбирующих групп. Поэтому лучше привязывать к аффинному лиганду пространственную группу и только модифицированный таким образом лиганд присоединять к нераствори-мовду носителю. В результате образования связи между поверхностью нерастворимого носителя и аффинным лигандом не должно возникать ни в носителе, ни в аффинном лиганде неспецифически сорбирующих групп эта связь должна быть устойчивой в ходе сорбции, десорбции и регенерации (см. разд. 8.5). При выборе метода необходимо принимать во внимание также зависимость устойчивости аффинного лиганда от pH. Кислые протеина-зы, например, нельзя связывать в щелочных средах, поскольку они будут при этом инактивироваться. Поэтому в табл. 8.12 приводится также значение pH, при котором проводится связывание. Однако во многих методах могут быть получены хорошие результаты даже при низких pH (связывание в нейтральной среде на [c.229]

Фракционируемый материал может содержать компоненты, которые изменяют активность присоединенного аффинного лиганда. Эти компоненты могут быть близки выделяемым соединениям, хотя это и не обязательно. Ферменты, например протеиназы и нуклеазы, присутствующие в неочищенных экстрактах, могут расщеплять присоединенные аффинные лиганды (белки, нуклеиновые кислоты) и тем самым уменьшать емкость сорбента для связывания специфически комплементарного соединения. Кроме такой неспеиифиче-ской деградации аффинного лигапда ферменты и другие химические соединения, присутствующие в фракционируемой смеси, могут специфически модифицировать свойства присоединенного аффинного лиганда, приводя к образованию форм с сохраиеиной, но измененной активностью. [c.274]

Оптимальные условия связывания, pH, состав буферного раствора и температура, в значительной степени зависят от характера аффинного лиганда. Наиболее эффективно реакция проходит при pH 8—10, однако, если этого требует природа аффинного лиганда, можно использовать и более низкие значения pH. Аффинный лиганд, особенно белковой природы, растворяют в буфере с высокой ионной силой (около 0,5), чтобы предотвратить неспецифическую сорбцию, например белка на белке, которая обусловлена полиэлектролитной природой белков. Для последующей отмывки сорбента используются растворы с более высокой ионной силой. Можно применять карбонатные или бо- ратные буферы с добавкой хлорида натрия. Количество присоединенного лиганда зависит от соотношения в реакционной смеси аффинного лиганда и объема геля, pH, природы самого лиганда (числа реакционноспособных групп и т. д.), а также от длительности проведения реакции и температуры. Например, при иммобилизации химотрипсина к 2 мл NBr-акти Вированной сефарозы при pH 8 присоединяется только 5 мг из 10 мг взятого белка, из 20 мг белка связывается примерно 8 мг, а из 30 мг — примерно 10 мг. При комнатной температуре (20— 25 °С) связывание обычно завершается за 2 ч, при пониженной температуре рекомендуется увеличить длительность реакции до 16 ч, т. е. оставлять реакционную смесь на ночь. В процессе связывания реакционную массу необходимо перемешивать, но применять магнитную мешалку не рекомендуется, так как при таком перемешивании можно разрушить гель. Лучше всего перемешивать реакционную смесь встряхиванием. Когда реакция закончится, гель переносят на пористый стеклянный фильтр и промывают тем же буферным раствором, в котором проводилось связывание. Оставшиеся активные группы рекомендуется блокировать, с этой целью гель обрабатывают 2 ч 1М этанола-мином при pH 8. Конечный продукт следует промыть 4—5 раз буферным раствором с высоким или низким pH. Например, можно использовать ацетатный (0,1 М, pH 4) или боратный буферный (0,1 М, pH 8,5) раствор, содержащий 1 моль/л хлорида натрия. Как уже упоминалось во введении, все нековалентно связанные соединения следует отмыть. [c.20]

Вообще тщательную промывку аффинного сорбента перед его использованием, а особенно после длительного хранения следует предусмотреть в любом варианте аффинной хроматографии. Дело в том, что при хранении идет медленный гидролиз связей лигандов с матрицей, приводящий к освобождению, или подтеканию , лигандов ( leakage , bleeding ). Это явление опасно не уменьшением емкости сорбента (на доли процента), а тем, что перешедшие в раствор молекулы лиганда могут оказаться на два-три порядка более активными в отношении связывания вещества, чем иммобилизованные молекулы. Это создает ситуацию конкурентной элюции в тот момент, когда должна происходить посадка вещества на сорбент. Результатом такой ситуации может оказаться заметное уменьшение и даже полное отсутствие задержания вещества на сорбенте. Подтекание лигандов может происходить не только за счет отрыва их ковалентно связанных молекул от матрицы, но и в результате постепенной десорбции тех молекул лиганда, которые не были отмыты после посадки его на матрицу. [c.410]

Аффинная хроматография НК на сорбентах, лигандами которых являются тоже нуклеиновые кислоты, базируется на их комплементарном взаимодействии с образованием достаточно прочных двунитевых структур — двунитевых ДНК и РНК нли ДНК—РНК-гибридов. Такие структуры образуются и надежно сохраняются лишь тогда, когда строго комплементарные участки имеют протяженность в десятки нуклеотидных звеньев. Эта степень соответствия не может быть случайной, а реализуется только в том случае, когда одна из НК была синтезирована по матрице второй НК (или ей идентичной). Разумеется, как иммобилизованная НК, так и очищаемая должны быть однонитевыми, а условия связывания с сорбентом должны быть благоприятными для их гибридизации. [c.441]

Для синтеза аффинного сорбента, соответствующего специфичности данного фермента, лиганд (субстрат или его аналог) присоединяют к инертной матрице (макропористые гидрофильные гели, синтетические полимеры, неорганические носители). Для уменьшения пространственных трудностей при взаимодействии фермента с матрвдей лиганд присоединяют к носителю через промежуточное звено (вставку, ножку, спейсер). Присоединение лигандов к поперечносшитой агарозе — сефарозе обычно проводят, активируя ее бромцианом (см. с. 91). Связывание с сефарозой, активированной бромцианом, л-амино-бензилянтарной кислотой, используемой в качестве лиганда, обеспечивает взаимодействие сорбента с каталитическим центром только карбоксипептидаз благодаря сходству лиганда с субстратами карбоксипептидазы [c.82]

Против уравнений, выведенных Данном и Чейкеном [6], Николь и др. [12] высказали возражения. Данн и Чейкен [7] ограничились случаями, когда [Е]//Сь мало, т. е. используется очень низкая концентрация фермента. Другое ограничение касается взаимодействий со слишком низкими Кь- Например, если константа связывания равна 10 моль/л, то рассчитанная константа скорости диссоциации комплекса ЕЬ должна быть очень мала ( 0,042 С ) [7]. Следовательно, элюирование белка должно зависеть от кинетических факторов и не может быть проведено за реальное время опыта. Добавление растворимого лиганда к раствору элюента не должно оказывать влияния на элюирование белка, поскольку диссоциация — мономолекулярный процесс. Такими кинетическими эффектами объясняются наблюдаемые иногда неудачи при элюировании некоторых ферментов с аффинных сорбентов буферными растворами, содержащими сильные ингибиторы. В некоторых случаях белковый ник настолько уширяется, что его нельзя обнаружить. Метод пригоден главным образом для случаев, когда доступны сорбенты, содержащие лиганды со средней силой связывания. В таких случаях система полностью обратима в пределах времени проведения хроматографического опыта. [c.49]

Для исследования специфического связывания биологически активных макромолекул с клеточными рецепторами широко применяются методы аффинной хроматографии. Основной недостаток обычных аффинных сорбентов — низкая эффективность использования специфических рецепторов при их химической пришивке к пористому инертному носителю, а также потеря нативности и некоторых физиологических функций рецепторов из-за процедуры химической модификации. В литературе описан метод получения аффинных сорбентов на основе фрагментов клеточных мембран эритроцитов, лимфоцитов и гепатоцитов, иммобилизованных в матрицу полиакрилонитрила. Эти сорбенты проявляют высокую тканеспецифическую селективность связывания своих природных белков-лигандов (Грушка и др., 1988 Чернова, Гуревич, 1996). Аналогичные сорбенты могут быть использованы для определения селективности связывания пептидов и НПК с клеточными мембранами определенной дифференцированной ткани. [c.180]

Оптимальными /шгандами для аффинной хроматографии ферментов являются соответствующие субстраты, однако в общем случае их применению мешает быстрое превращение в продукты ферментативной реакции и как следствие снижение эффективности и деструкция сорбентов. Тем не менее субстраты могут быть использованы в качестве лигандов, если при определенных условиях скорость каталической реакции понижена, а связывание с ферментом остается достаточно сильным. Такие условия могут быть созданы путем понижения температуры (от —2 до —50 °С), когда прочность фермент-субстратного комплекса достаточна для удерживания фермента на колонке, в то время как его десорбция легко достигается при повышении температу-ры [5]. [c.189]

При проведении аффинного элюирования необходимо учитывать некоторые аспекты взаимодействия лиганд — макромолекула. Увеличение концентрации соли может значительно уменьшить биоспецифическое взаимодействие, но может также ослабить последующее взаимодействие со свободным лигандом при аффинном элюировании. Увеличение концентрации соли уменьшает неспецифические ионные взаимодействия, но может также усиливать гидрофобные взаимодействия, особенно при наличии на сорбенте полиметиленовых вставок. Если важную роль при связывании играют гидрофобные взаимодействия, то более эффективным может быть уменьшение концентрации соли. Кроме того, можно использовать изменение pH или введение агентов, уменьшающих поверхностное натяжение (для ослабления гидрофобных и вандерваальсовых взаимодействий). В качестве последних могут применяться неионный детергент, такой, как тритон Х-100 до 1%-ной (об./об.) концентрации в буфере, зтиленгликоль [10—50% (об./об.)] или относительно небольшие количества этанола [до 5% (об./об.)]. Маловероятно, чтобы эти вещества могли вызывать изменения константы ассоциации с заряженными лигандами. После предварительного уравновешивания колонки указанным буфером в него вводят лиганд для аффинного элюирования. Очевидно, могут быть использованы также аллостерические модифицирующие агенты или ингибиторы взаимодействия лиганд — макромолекула, причем приведенное выше обсуждение по применению свободного лиганда полностью относится и к указанным агентам. [c.114]

Смотреть страницы где упоминается термин Аффинные лиганды связывание на сорбенте: [c.201] [c.161] [c.178] [c.232] [c.8] [c.10] [c.11] [c.21] [c.368] [c.380] [c.405] [c.451] [c.56] [c.90] [c.101] [c.151] [c.20] [c.193] [c.20]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология