Агароза аффинных лигандов

Разновидность количественной аффинной хроматографии — фронтальный анализ [10] он основан на понятии плотности о аффинного лиганда на единицу длины колонки с агарозой. Если / — общая длина колонки с агарозой, а Li — общее количество им мобилизованного лиганда в сорбенте, то о = - г/ - Если аффинный сорбент характеризуется слабым сродством, то раствор фермента в концентрации [ 0] наносится на колонку непрерывно, а для элюирования фермента с колонки необходим объем V. Можно написать следующее уравнение [c.51]

ВЫСОКОЙ концентрацией аффинного лиганда является слишком сильное взаимодействие с выделяемым вешеством, что затрудняет его элюирование. Так, например, тщательный контроль концентрации лиганда имеет решающее значение для выделения глюкокиназы на агарозе со связанной N-(6-аминогексил)-2-амино-2-дез-оксн-D-глюкопиранозой [14] (рис. 5.6). [c.81]

Тип 6. Связь образуется по реакции аффинного лиганда с активированной бромцианом агарозой. Природа связи неизвестна [32, 59]. [c.143]

Связывание аффинных лигандов с агарозой, активированной бромцианом [c.188]

В табл. 8.4 приведены количества аффинного лиганда, связанного с 2, 4 и 6%-ной агарозой, а также рассчитанные значения ожидаемой плотности гидроксильных групп в различных гелях агарозы. Выход в реакции химического присоединения для [c.192]

Количество исследований, в которых в качестве нерастворимого носителя применяется агароза и ее производные с привитыми аффинными лигандами, увеличивается по мере развития аффинной хроматографии, и полный обзор таких работ в рамках одной главы практически невозможен. Так, в 1968 г. были опубликованы всего две работы, описывающие использование агарозы в качестве носителя в аффинной хроматографии, в 1969 г. таких работ было уже примерно 10, а в 1970 г. — около 20, а в 1971 г. — более 40, в 1972 г. — более 70, а в последующие годы это число было вновь превышено. В табл. 7.3 приведены некоторые примеры использования агарозы в аффинной хроматографии, показывающие возможности этого метода. [c.38]

Подобным образом Нишикава и др. [24] сопоставили гели, содержащие различные концентрации аффинанта, с учетом распределения лиганда в геле и рассмотрели как емкости по ферменту на единицу геля, так и аффинности гелей к ферменту. Концентрация лигандов в геле влияет на оба эти свойства, но не в одинаковой степени. Гранулы геля с высокой концентрацией аффинанта обладают высоким сродством и соответственно высокой емкостью в колонке. Если гель разбавить немодифицированной агарозой, концентрация лиганда внутри геля в модифицированных [c.77]

Сорбент должен проявлять минимальную неспецифическую сорбцию. При приготовлении нерастворимого аффинного лиганда важно, чтобы он прикреплялся, к носителю только ковалентной связью, а молекулы аффинного лиганда, не связанные ковалентно, должны быть отмыты. Это трудно осуществить, если носитель сильно адсорбирует молекулы аффинного лиганда. Подобным об-разолц если выделяют вещества, образующие специфический и обратимый комплекс со связанным аффинным лигандом, важно, насколько это возможно, чтобы только эти вещества задерживались на колонке с нерастворимым аффинным сорбентом и только в виде специфического комплекса со связанным аффинным лигандом. Это является одной из причин, почему носители, которые содержат ионогенную группу, такие, как сополимер этилена с малеиновым ангидридом, у которого остается ряд свободных кар- боксильных групп после присоединения аффинного лиганда, никогда не будут столь широко применяться в аффинной хроматографии, как нейтральная агароза. [c.176]

Присоединение аффинных лигандов к декстрановым гелям может быть осуществлено с помощью ряда методов, описанных для целлюлозы, а также агарозы (см. ниже), а именно связывание после активации бромцианом, триазиновый метод, связывание с использованием эпоксидов или бифункциональных производных или связывание через ацилазидные промежуточные соединения. [c.183]

Для активации больших количеств агарозы и для активации мембран из агарозы или тонких слоев агарозы, покрьгваюш,их стеклянные шарики, Порат и др. [54] разработали очень простой и воспроизводимый метод активации в щелочном фосфатном растворе очень высокой буферной емкости при этом отпадает необходимость контроля pH и интенсивного перемешивания. Найдены условия для высокой, средней и низкой степеней активации, которые выбираются, исходя из природы связываемого аффинного лиганда. Кроме того для высокой степени активирования гелей, были выбраны условия как для гелей с низким содержанием агарозы [р=1—4%), так и с высоким (р = 4—8%) содержанием. Методики даны для гелей с разным содержанием р, %) агарозы в набухшем геле. [c.191]

Присоединение аффинных лигандов к агарозе с помощью бифункциональных оксиранов [71] [c.194]

Наряду с описанными выше для связывания аффинных лигандов с агарозой используется также триазиновый метод. Первоначально он был разработан Кеем и Лилли [33] для связывания аффинных лигандов с целлюлозой (разд. 8.2.1) с помощью 2-ами-н0-4,6-дихл0р-си.. ил1-триазина. [c.197]

Присоединение аффинных лигандов с помощью -оксисукцинимидных эфиров агарозы [c.197]

Для солюбилизации модифицированных агароз предложено несколько методов, позволяющих количественно спектрофотометриро-вать иммобилизованные аффинные лиганды [47]. Гели агарозы могут быть растворены в горячей воде, немодифицированная агароза растворяется при 60 °С. При последующем охлаждении высококонцентрированных водных растворов агарозы получаются непрозрачные растворы, в то время как более разбавленные растворы становятся вязкими, но остаются прозрачными. Эти эффекты не зависят [c.245]

К матрице аффинного сорбента, помимо общих для всех хроматографических матриц требований (нерастворимость п гидрофильпость, жесткость, подходящая форма и размер гранул, химическая стабильность в условиях модификации и в самом хроматографическом процессе, отсутствие неспецифической адсорбцип ж др.), предъявляется требование наличия химических групп, позволяющих с помощью несложной химической реакции ковалеитио связывать с матрицей разнообразные биологические молекулы (лиганды и спейсе-ры). Наиболее удобными с этой точки зрения оказались гидроксильные группы полисахаридных матриц — агарозы и сефадексов, а также амидные группировки полиакриламидного геля. Если иметь в виду аффинную хроматографию белков или использование белко- [c.342]

Чаще всего связывание аффинного лиганда с агарозой проводят по методу, разработанному Аксеном, Поратом и Эрнбеком [4, 76]. После химической активации бромцианом в щелочной среде агароза ковалентно связывает соединения, содержащие первичные алифатические или ароматические аминогруппы. Степень активации, измеряемая по способности к связыванию небольших пептидов, пропорциональна значению pH в процессе активации [3], т. е. она растет с увеличением pH. Аксен и Эрнбек [3] иредложиши возможную схему процесса активации. [c.14]

Считается, что сефароза устойчива в области pH 4—9 с ней не рекомендуется работать при температурах иже 0°С или выше 40 °С. Сефароза устойчива к действию концентрированных растворов солей или мочевины. Куатреказас [14] указывает,, что на частицы агарозы существенно не влияет продолжительное воздействие 6М раствора гуанидинхлорида или 7М раствора мочевины. Поэтому агарозные аффинные сорбенты можно отмывать от белков этими денатурирующими растворами. В течение 2—3 ч при комнатной температуре на агарозу не действуют 0,1М гидроксид натрия или 1М хлорная кислота. Ни 50%-ный (по объему) водный диметилформамид, ни 50%-ный (по объему) водный этиленгликоль не меняют структуру агарозы. Эти растворители полезны при аффинной хроматографии относительно плохо растворимых в воде соединений, например тироксина и стероидов. Аффинные сорбенты на основе сефарозы можно хранить при 4° С в виде водной суспензии с до бавкой антибактериального агента. Длительность хранения определяется лишь стабильностью связанного аффинного лиганда. Однако агарозные аффинные сорбенты полностью разрушаются при высушивании или замораживании. Согласно данным Аксена и Эрнбека )[3], эти сорбенты можно лиофилизовать, если добавить к ним декстран, глюкозу и сывороточный альбумин. Химическая стабильность биогеля А такая же, как у сефарозы. [c.16]

Выделение пикомолярных и наномолярных количеств белков осложняется относительно легким отщеплением аффинных лигандов в раствор. Эти проблемы исторически возникли в первую очередь ввиду того, что аффинные лиганды связывались моновалентно через вставку с бромцианактивированной агарозой в присутствии соединений (например, буферов и белков), содержащих нуклеофилы. [c.103]

К типичным гидрофобным адсорбентам, имеющимся в продаже, относятся адсорбенты, в состав которых входят линейные алифатические цепи, содержащие 4, 6, 8 и 10 атомов углерода (Р. Ь. В1осНеш1са18), а также адсорбенты с такими же цепями, но имеющими концевую аминогруппу (рис. 4.51,Л). Адсорбенты последнего типа предназначены преимущественно для присоединения аффинных лигандов, однако они сами по себе представляют интересные гидрофобные адсорбенты, в которых имеется группа, потенциально способная к образованию водородных связей и электростатическим взаимодействиям. Важно также отметить, что эти адсорбенты делаются на основе агарозы, активированной бромцианом, и поэтому содержат положительно заряженную группу на другом конце алифатической цепи (см, рис. 4.35). Доступны также фенилагарозы, в которых бензольное кольцо связано с матрицей через простые эфирные связи с глицерином (например, фенилсефароза рис. 4.51, ). [c.183]

Кислый аминополисахарид гепарин [М> 10 ООО) известен в качестве антикоагулянта крови. Кроме того, он применяется в биохимии как ингибитор рибонуклеаз. Это его качество, по-видимому-отражает некоторое сходство полимера, содержащего две-три суль, фогруппы на каждую дисахаридную структурную единицу, с РНК-Две эти особенности определили использование гепарина в качеств, лиганда для аффинной хроматографии факторов коагуляции крове и (особенно широко) для очистки белков, взаимодействующих и нуклеиновыми кислотами (полимераз, обратной транскриптазы, рес стриктаз, факторов инициации и элонгации белкового синтеза и др.). Кроме того, иммобилизованный гепарин связывает липопротеид-липазы и некоторые липопротеиды. Гепарин-агароза выпускается всеми упомянутыми фирмами-поставщиками аффинных сорбентов, кроме Bio-Rad . [c.370]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология