Аффинные взаимодействие с ферментом

Преимуществом колоночной хроматографии является возможность количественного фракционирования больших количеств веществ без превращения их в какие-либо производные. Однако хорошее разделение часто возможно лишь при малых скоростях элюирования, поэтому были разработаны новые виды колоночной хроматографии. Методы аффинной и адсорбционной хроматографии основаны на избирательной адсорбции молекул на нерастворимом адсорбенте, который содержит группы (молекулы), специфически взаимодействующие с молекулами подлежащих очистке соединений, например ингибиторы (для очистки ферментов) или антитела (для очистки антигенов) в настоящее время эти методы нашли широкое применение и для разделения углеводов. Невзаимодействующие с адсорбентом примеси удаляются, а связанный с адсорбентом сахар затем десорбируют способом, не приводящим к его разрушению. Десорбцию можно осуществить, изменяя pH, ионную силу среды или применяя соответствующий ингибитор взаимодействия, удерживающего вещество на адсорбенте. Для разделения ряда полисахаридов были использованы иммобилизованные формы (см. разд. 26.3.7.6) конканавалина А [40], являющегося фитогемагглютинином (лектином), который специфически взаимодействует с разветвленными полисахаридами определенного строения в настоящее время применяют и другие иммобилизованные фитогемагглютинины. Колоночная хроматография на носителях, покрытых полиароматическими соединениями [41], также находит применение для разделения полисахаридов. Благодаря достижениям в производстве носителей для жидкостной хроматографии под высоким давлением можно осуществить хроматографическое разделение быстро и избирательно описаны методы фракционирования небольших олигосахаридов, продолжающегося менее 1 ч [42]. [c.224]

Рис. 6.1. Изотерма адсорбции для четырех 1, 2, 3 1 4) ферментов, взаимодействующих с одним и тем же иммобилизованным аффинным лигандом [35].

Именно при изучении влияния микроокружения на специфические взаимодействия важную роль начинает играть метод аффинной хроматографии. Как подробно показано в гл. 4, возможно, напри.мер, использовать колонку с иммобилизованным ингибитором н вытеснять специфически сорбируемый фермент растворами его ингибиторов в различных концентрациях. Па основе объемов элюата могут быть рассчитаны константы диссоциации фермента как со связанным, так и с растворенным ингибитором. Если использовать тот же ингибитор для связывания на нерастворимой подложке и для элюирования специфически сорбированного фермента, то информацию о влиянии окружения на образование комплекса можно получить, основываясь на различиях, если таковые имеются, в величинах определяемых констант диссоциации. Поскольку специфические взаимодействия играют очень важную роль в большинстве процессов, протекающих в природе, разработка простого метода определения констант диссоциации комплексов несомненно имеет важное значение. [c.12]

Использование аффинной хроматографии для определения, например, констант ингибирования ферментов, по-видимому, весьма перспективно. Данные об объемах элюатов, содержащих фермент, на колонке с иммобилизованным ингибитором, полученные при использовании различных концентраций ингибитора в растворе, позволяют определить константы ингибирования как для связанного ингибитора, так и для ингибитора в растворе. Метод детально рассмотрен в гл. 4. Большое преимущество этого метода состоит в том, что при использовании одного и того же ингибитора как для иммобилизации, так и для элюирования можно непосредственно сделать выводы о влиянии связей с носителем и природы носителя на изучаемое взаимодействие на основании совпадения или различий в определяемых величинах констант диссоциации. Следовательно, метод аффинной хроматографии открывает новые возможности не только для изучения взаимодействия биологически активных веществ, он перспективен также и для выяснения влияния микроокружения на образование этих комплексов. [c.19]

Следует заметить, что прямое присоединение красителя к остову матрицы не уменьшает способность красителя связывать ферменты, т. е. в этом случае не нужен удлиняющий мостик. Как упоминалось в предыдущем разделе, причина, по которой при слабом взаимодействии фермента с лигандом необходим мостик, заключается не столько в возможности расположить лиганд на некотором расстоянии от матрицы, сколько в том, что введение мостика приводит к появлению неспецифических сил взаимодействия, усиливающих связывание. При величине /Сг(/Ср), лежащей в пределах 10 М, и высоких значениях т< для хорошей адсорбции белка на колонках с окрашенным адсорбентом не требуется дополнительных взаимодействий. Это видно из уравнения (4.5), например, при т< = 0,1 мМ, р<= =0,05 мМ и /Гр=0,001 мМ а = 0,98. Из сказанного должно следовать, что окрашенные адсорбенты идеально приспособлены для белков, связывающих нуклеотиды, особенно в сочетании с аффинной элюцией. На практике же возникает ряд трудностей. Главная из них заключается в неспецифических силах связывания, которые могут быть причиной менее эффективной аффинной элюции. Кроме того, существует такое множество белков, связывающих нуклеотиды, что если все эти белки, присутствующие в смеси, адсорбируются на колонке, то высокой степени очистки получить не удастся. [c.166]

Весьма важное место принадлежит аффинной хроматографии [116, 117]. Она основана на использовании особых адсорбентов, специфически взаимодействующих с макромолекулами и избирательно удерживающих данный вид макромолекул (отсюда и название метода). Примером, о котором уже говорилось в разд. Г.10, служит адсорбция комплементарных фрагментов молекулы нуклеиновой кислоты на иммобилизованной ДНК. Аффинная хроматография используется также для очистки ферментов, антител и других белков, способных прочно связываться со специфическими малыми молекулами. [c.161]

Аффинная хроматография (хроматография по сродству). Основана аффинная хроматография на принципе избирательного взаимодействия белков (или других макромолекул) с закрепленными (иммобилизованными) на носителе специфическими веществами-лигандами, которыми могут быть субстраты или коферменты (когда выделяют какой-либо фермент), антигены (или антитела), гормоны или рецепторы и т. д. Благодаря высокой специфичности белков к иммобилизованному лиганду, связанному с носителем (которым заполняют хроматографическую колонку), присоединяется только один какой-либо белок из смеси. Снятие с колонки этого белка осуществляют элюированием буферными смесями с измененным pH или [c.29]

Для синтеза аффинного сорбента, соответствующего специфичности данного фермента, лиганд (субстрат или его аналог) присоединяют к инертной матрице (макропористые гидрофильные гели, синтетические полимеры, неорганические носители). Для уменьшения пространственных трудностей при взаимодействии фермента с матрвдей лиганд присоединяют к носителю через промежуточное звено (вставку, ножку, спейсер). Присоединение лигандов к поперечносшитой агарозе — сефарозе обычно проводят, активируя ее бромцианом (см. с. 91). Связывание с сефарозой, активированной бромцианом, л-амино-бензилянтарной кислотой, используемой в качестве лиганда, обеспечивает взаимодействие сорбента с каталитическим центром только карбоксипептидаз благодаря сходству лиганда с субстратами карбоксипептидазы [c.82]

Начаты разработки новых поколений биодатчиков на базе аффинных взаимодействий (биосродства) типа фермент-ингибитор, антитело-антиген, агонист (антагонист)-клеточный рецептор, а также на основе полупроводниковых структур и мезоэлектричес-кого эффекта. Последние два биодатчика дают возможность создавать сенсоры, чувствительные к газам, что имеет существенное значение для создания роботов, реагирующих на изменения внешних воздействий. [c.102]

Связываемость отражает меру силы взаимодействия фермента с иммобилизованным нуклеотидом и соответствует концентрации (ммоль/л) КС1 в центре пика фермента при элюировании фермента линейным градиентом концентрации K 1. На колонку (50X5 мм), содер-жащую 1 г аффинного сорбента, наносили 5 Е фермента. I — 1,5 мкмоль/мл АМР, II — 6,0 мкмоль/мл АМР. [c.60]

Изучение влияния pH и температуры проведено на адсорбентах, специфичных к группе ферментов 10, 11]. Влияние pH на связывание лактатдегидрогеназы из сердечной мышцы с двумя аффинными адсорбентами представлено на рис. 6. Взаимодействие фермента с обоими адсорбентами явно не зависит от концентрации ионов водорода в растворе вплоть до pH 8, но в более щелочной области наблюдалась зависимость от природы адсорбента. В случае б-аминогексаноил-ЫАО+-сефа-розы поведение фермента характеризовалось кажущейся константой рК 8,5, в то время как для Ы -(6-аминогексил)-5 -АМР-сефарозы р/С 9,7. Различия между значениями кажущихся констант рК, определенных для двух иммобилизованных [c.109]

Первоначально передо мною стояла цель сделать обзор выделенных методом аффинной хроматографии веществ, а также кратко обсудить наиболее существенные моменты, знание которых необходимо для усиеплного применения этого метода. Однако изучение литературы привело меня к мысли о том, что аффинная хроматография далеко не ограничивается выделением веществ. В связи с тем что в ее основе лежит образование специфических комплексов, например ферментов с их ингибиторами, антител с антигенами, лектинов с сахарами и гликопротеинами и т. д., аффинная хроматография является весьма полезной также и при изучении этих специфических взаимодействий. [c.7]

В реакциях взаимодействия фермента с субстратом константа равновесия (К) неизменна при различных концентрациях субстрата. При связывании же антител с гомологичным антигеном дело обстоит иначе — популяция поликлональных антител гетерогенна по этой константе, т. е. по величине аффинности. Ранее предполагалось, что в любой антисыворотке количественное распределение антител по аффинности имеет характер нормального (Гауссова) распределения. Как геперь установлено, это предположение было ошибочным. Графический анализ данных по аффинности для реакции между антисывороткой и антигеном показывает, что распределение антител по аффинности не соответствует нормальному (рис. 9.16). Однако среднюю аффинность популяции антител в данной антисыворотке (Кд) можно определить с хорошим приближением как величину, обратную такой концентрации свободного антигена, которая необходима для насыщения половины всех антигенсвязывающих центров антител = 1/[Аг , д5 ]. [c.157]

Наиболее эффективным и распространенным способом очистки является хроматографическое фракционирование. Характерной чертой использования этого приема для очистки рестриктаз является то, что решение задачи получения функционально очищенных препаратов этих ферментов достигается путем применения ограниченного круга сорбентов. Наряду с традиционными сорбентами — ДЭАЭц, ФРП, ГАП, карбоксиметилцел-люлозой и носителями для гельфильтрации для очистки специфических эндонуклеаз в настоящее время используются и сорбенты, для которых предполагается участие в связывании рестриктаз не только ионных, но и гидрофобных и аффинных взаимодействий. В отношении последних двух типов взаимодействия следует отметить, что они во многих случаях только постулированы, но не доказаны соответствующими экспериментами. Тем не менее, апробация новых сорбентов для очистки рестриктаз дала положительные результаты. [c.155]

Высокую эффективность ФР II скорее всего следует отнести за счет возможного участия аффинных взаимодействий рестриктаз с этим сорбентом. В этом отношении больший интерес представляют данные, полученные с применением другого аффинного катионита — ГС. Ее использование на первых хроматографических стадиях выделения, последовавших после удалё-ния нуклеиновых кислот, дало 20-ти кратную [118, 302], 75-ти кратную [299] и 100-кратную [33] очистку. Выходы целевых ферментов во всех цитированных случаях превышали 80%. Только в случае выделения рестриктазы SalG I очистка и выход равнялись соответственно 3-кратной и 30% [177]. Однако в этом случае хроматография на ГС осуществлялась на предпоследней стадии и дала препарат, в котором больше чем половина белка приходилась на рестриктазу SalG I. Поэтому эти данные нельзя рассматривать, как свидетельствующие о низкой эффективности ГС в случае очистки указанного фермента. [c.169]

Отправные положения концепции картирования активных центров деполимераз, развитой Тома [1, 2] и впоследствии совместно с Алленом [3—5] независимо от Хироми, в целом согласуются с концепцией последнего. Предполагается, что а) мономерные остатки поли- или олигомерного субстрата, удаленные от его реакционного центра, могут взаимодействовать с активным центром фермента б) сорбционная область активного центра состоит из определенного числа сайтов, геометрически комплементарных мономерным звеньям субстрата в) каталитический участок фермента расположен между двумя определенными сайтами активного центра. Картирование активного центра заключается в экспериментальном определении числа сайтов связывающей области активного центра фермента, вычислении показателей сродства или аффинности каждого сайта по отношению к мономерным остаткам биополимера (обьппю гомополисахарида) и определении положения каталитического участка в активном центре. [c.62]

По своему существу аффинная хроматография — это особый тип адсорбционной хроматографии. В отличие от того, что было описано в гл. 6, адсорбция здесь осуществляется за счет биоспецифп-ческого взаимодействия между молекулами, закрепленными на матрице, т. е. связанными в неподвижной фазе, и комплементарными к ним молекулами, подлежащими очистке или фракционированию, поступающими, а затем элюируемыми с подвижной фазой. Биоспеци-фическое взаимодействие отличается исключительной избирательностью, а зачастую и очень высокой степенью сродства между партнерами. Оно лежит в основе множества строго детерминированных процессов, протекающих в организме. В качестве примеров можно назвать взаимодействия между ферментами и их субстратами, кофакторами или ингибиторами, между гормонами и их рецепторами, между антигенами и специфическими для них антителами, между нуклеиновыми кислотами и специфическими белками, связывающимися с ними в процессе осуществления своих функций (полимераза.мп, нуклеазами, гистонами, регуляторными белками), а также между самими нуклеиновыми кислотами-матрицами и продуктами их транскрипции. Наконец, многие малые молекулы (витамины, жирные кнслоты и др.) специфически связываются со специальными транспортными белками. [c.339]

По механизму взаимодействия сорбента и сорбата можно выделить несколько видов хроматофафии распределительнся хроматография основана на различии в растворимости разделяемых веществ в неподвижной фазе (газожидкостная матофафия) или на различии в растворимости веществ в подвижной и неподвижной жидких фазах ионообменная хроматография — на разной способности веществ к ионному обмену адсорбционная хроматография — на различии в адсорбируемости веществ твердым сорбентом эксклюзионная хроматография — на различии в размерах и формах молекул разделяемых веществ, аффинная хроматография — на специфических взаимодействиях, характерных дпя некоторых биологических и биохимических процессов. Существуют пары веществ, реагирующих в растворах с высокой избирательностью, например антитело и антиген, фермент и его субстрат или ингибитор, гормон и соответствующий рецептор, и т. п. Если одно из соединений пары удерживается ковалентной связью на [c.267]

Хроматографические методы, в которых разделение компонентов смеси основано на различии в размерах, форме или суммарном заряде молекул, часто недостаточно эффективны для разделения смесей белков. В таких случаях может оказаться полезной аффинная хроматография [48]. Успех метода зависит от того, удастся ли найти вещество, которое будет специфически взаимодействовать с подлежащим очистке белком. Для фермента таким веществом может быть конкурентный ингибитор катализируемой этим ферментом реакции, а для участвующего в гормональной регуляции белка-рецептора — соответствующий гормон. Это вещество связывают с подходящим нерастворимым гидрофильным носителем, и полученный материал используют при хроматографии как стационарную фазу. Вещества такого типа часто сами оказываются большими природными макромолекулами, и приемы, используемые для соединения их с носителями, сходны с методами приготовления иммобилизованных ферментов [см. разд. 27.4.2 (5)]. Реакции, с помощью которых белки, содержащие аминогруппы или фенольные группировки, могут быть связаны с носителем на основе сшитого полиакриламида, содержащего некоторое число гидразидных или 4-аминоанилидных остатков (схемы 30, 31 Б — остаток белка). Хорошие результаты получены в тех случаях, [c.322]

Лиганд. Любая молекула, низкомолекулярная или высокомолекулярная, способная специфически взаимодействовать с белком, нуклеиновой кислотой или другой молекулой, которую нужно очистить, потенциально может быть пригодна в качестве лиганда для аффинной хроматографии. Многие лиганды, такие, как субстраты ферментов, лектины или антигены, взаимодействуют только с одним типом белка или по крайней мере с очень ограниченным кругом белков. Другие, такие, как коферменты (NAD, NADP), нуклеотиды (АТР, АМР, сАМР и т. д.) и иммобилизованные красители, специфически взаимодействуют с более широким, хотя и ограниченным кругом макромолекул и известны как группспецифические лиганды. [c.445]

Аффиная хроматография является самостоятельной областью жидкостно-адсорбционной хроматографии, выделяемой по специфическому механизму взаимодействия разделяемых веществ с сорбентом. Метод основан на характерной особенности биологически активньгх веществ селективно и обратимо связывать определенные вещества, называемые аффинными лигандами или аффиантами. Таким образом, ферменты связывают соответствующие ингибиторы, антитела — антигены, гормоны — их рецепторы и т.п. Если по аналогии с обращенными фазами приготовить сорбенты с привитыми аффинными лигандами, появляется возможность селективного хроматографического выделения близких по свойствам биологически активных соединений и их разделения между собой. Наиболее часто применяемые аффинные лиганды приведены в табл. 3.65. [c.201]

Против уравнений, выведенных Данном и Чейкеном [6], Николь и др. [12] высказали возражения. Данн и Чейкен [7] ограничились случаями, когда [Е]//Сь мало, т. е. используется очень низкая концентрация фермента. Другое ограничение касается взаимодействий со слишком низкими Кь- Например, если константа связывания равна 10 моль/л, то рассчитанная константа скорости диссоциации комплекса ЕЬ должна быть очень мала ( 0,042 С ) [7]. Следовательно, элюирование белка должно зависеть от кинетических факторов и не может быть проведено за реальное время опыта. Добавление растворимого лиганда к раствору элюента не должно оказывать влияния на элюирование белка, поскольку диссоциация — мономолекулярный процесс. Такими кинетическими эффектами объясняются наблюдаемые иногда неудачи при элюировании некоторых ферментов с аффинных сорбентов буферными растворами, содержащими сильные ингибиторы. В некоторых случаях белковый ник настолько уширяется, что его нельзя обнаружить. Метод пригоден главным образом для случаев, когда доступны сорбенты, содержащие лиганды со средней силой связывания. В таких случаях система полностью обратима в пределах времени проведения хроматографического опыта. [c.49]

Таким образом, чем сильнее взаимодействие субстрата и ингибитора с ферментом, тем выше комплементарность связываю-ших участков. Это справедливо не только в отношении пространственного расположения, но также и в отношении природы комп-лементирующих частей молекул. Однако способы привязки аффинного лиганда к нерастворимому носителю в значительной степени ограничены, потому что лиганд должен быть привязан той частью молекулы, которая не принимает участия в связывании. Кроме того, иммобилизация аффинанта не должна приводить к изменению его конформации или отрицательно влиять на природу его связывающих участков. Эффективность аффинного сорбента зависит от степени, до которой эти требования выполняются. [c.73]

Изменения аффинности и емкости Р -(6-аминогексил)-Р -(5 -аденозин) пирофосфат — сефарозы при разбавлении разными количествами немодифицированной сефарозы на примере взаимодействия с миокиназой хорошо видны в табл. 5.2 [8]. Разбавление аффинным сорбентом ведет к уменьшению связываемости р, выраженной через концсптрацпн хлорида калия, которые необходимы для элюирования фермента. Емкость сорбента, выраженная в единицах активности фермента, сорбированного па 1 мкмоль нуклеотида, возрастает при низких концентрациях нуклеотида, хотя абсолютная емкость на 1 г материала колонки с разбавлением уменьшается. [c.78]

Геометрия колонок, концентрация и общее содержание аффинного лиганда — вот три основных параметра, которые определяют и связываемость, и емкость носителя. Для систем с высокой аффинностью высота колонки с аффинным сорбентом, содержащим высокие концентрации лиганда, мало влияет связываемость зависит от концентрации аффинанта, а не от высоты колонки. Это имеет практическое значение колонки, содержащие высокие концентрации лиганда, можно использовать для концентрирования разбавленных растворов ферментов. Кроме того, в системах с высокой аффинностью, в которых элюирование адсорбированных макромолекул без денатурации затруднено, разбавление аффинного сорбента немодифицированным гелем или уменьшение концентрации лиганда может способствовать элюированию в более мягких условиях. В некоторых случаях, конечно, фермент различает только концентрацию лиганда в гранулах модифицированного геля, которая, однако, не меняется при разбавлении. В таких случаях трудности элюирования остаются даже после разбавления геля [11]. Для взаимодействий систем с низкой аффинностью очень важна геометрия колонки. Для разделения специфически адсорбированных белков от неадсорбированных наиболее выгодно использовать длинные колонки, а не короткие. [c.80]

В колоночной аффинной хроматографии достаточно сильное взаимодействие выделяемых веществ с иммобилизованным аффинным лигандом приводит к концентрированию вещества и его медленной миграции вниз по колонке. Этот процесс зависит от концентрации лиганда и почти не зависит от начальной концентрации свободных макромолекул. Например, в аффинной хроматографии глицерокиназы или лактатдегидрогеназы на К -(6-аминогексил)-5 -АМР— сефарозе не наблюдалось влияния концентрации фермента на емкость, если концентрации ферментов прямо пропорциональны концентрациям нуклеотида или зависимость между ними близка к таковой [21]. Необходимые при этом требования заключаются в том, что комплементарные макромолекулы следует наносить на колонку в ненасыщающих количествах, а также подбирать скорость потока раствора [19]. [c.82]

В этот обзор включены также аффинные лиганды с очень узкой специфичностью. Например, если к носителю прикрепить ингибитор, специфичный для единственного фермента, образующийся сорбент также будет специфичен только для данного фермента. Однако для использования специфических лигандов необходимо проводить различные и часто очень трудоемкие синтезы сорбента для каждого разделения. Не все аффинанты, которые подходят для комплементарного связывания макромолекул, имеют также подходящие функциональные группы для их прикрепления к нерастворимому носителю. Эти группы долл ны быть предварительно введены в аффинный лиганд, так же как и подходящей длины пространственная ножка , необходихмая главным образом для низкомолекулярных аффинных лигандов (она позволяет осуществлять их специфические взаимодействия с сорбируемым веществом). Практическая полезность специфических сорбентов возрастает, если для их приготовления вместо узко специфических лигандов использо-вать так называемый общий лиганд [37]. Очевидно, что матрица с групповой специфичностью, содержащая общий лиганд, проявляет аффинность к большой группе биологических макромолекул. Например, ферменты метаболизма аспарагиновой кислоты обнаруживают групповую специфическую [c.104]

Смотреть страницы где упоминается термин Аффинные взаимодействие с ферментом: [c.90] [c.164] [c.11] [c.170] [c.90] [c.342] [c.10] [c.367] [c.412] [c.182] [c.444] [c.500] [c.247] [c.60] [c.44] [c.45] [c.51] [c.64] [c.66] [c.70] [c.73] [c.90] [c.101] [c.105]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология