Сефароза активация

Активация сефарозы бромцианом [c.347]

Степень активации агарозы, оцениваемая данными о емкости по связыванию небольших пептидов [1], прямо пропорциональна pH. Активация проводится при pH 11. Методика активации сефарозы бромцианом детально описана ниже [2, 12, 55]. [c.189]

Эффективная активность лиганда под влиянием иммобилизации может меняться самым различным образом. На взаимодействие иммобилизованного лиганда с выделяемыми молекулами может оказывать значительное очень разнообразное влияние микроокружение, образуемое матрицей (плотность заряда, стерические препятствия и т. д.) оно же может также влиять и на структуру аффинного лиганда. Иммобилизация приводит также к изменениям в химической структуре, которые различным образом изменяют его молекулярные свойства. Так, например, существенную роль играет число связей между аффинным лигандом и нерастворимым носителем. Из сопоставления результатов, представленных на рис. 10,10,6 и в, следует, что неблагоприятное влияние возрастающего числа связей между молекулами соевого ингибитора трипсина и сефарозой 4В вызвано увеличением pH с 7,2 до 8,5 во время связывания белка после активации бромцианом. [c.274]

Нативная сефароза или сефароза, блокированная этанолами-ном сразу же после активации бромцианом, не адсорбируют белки [16]. Однако, если сефароза не блокирована тотчас же после активации, наблюдается неспецифическая сорбция белков, которая становится тем сильнее, чем больше проходит времени между активацией бромцианом и блокированием активных центров. Препарат человеческий сывороточный альбумин—сефароза, блокированный после 12 ч после присоединения сывороточного альбумина,, сорбирует только 0,4 мг белка на 1 мл геля. [c.277]

Свойства гидроксильных групп этого геля аналогичны свойствам гидроксильных групп агарозы. После активации бромцианом они, как и гидроксильные группы сефарозы, могут связываться с аминогруппами белков [88]. [c.24]

Активация сефарозы L 6В карбонилдиимидазолом [c.63]

Присоединение гонадотропина хориона человека к сефарозе L 4В с использованием активации реакционноспособным азокрасителем [c.95]

Рис. 1. Присоединение ГХЧ к сефарозе L 4В с использованием активации

В отличпе от сефадексов и обычной сефарозы, пористость сшитой сефарозы практически не лсеняется при переходе от водных растворителей к органическим. При этом она устойчива к пх воздействию, что облегчает проведение разнообразных химических реакций замещения с целью получения аффинных сорбентов. Вместе с тем отметим, что активация сефарозы L бромистым цианом (для присоединения аффинных лигандов) происходит с вдвое более низкой эффективностью, чем в случае обычной сефарозы. Это объясняется тем, что сшивка идет по тем же самым гидроксилам, что и активация с помощью Br N. [c.120]

Процедура активации состоит в следующем. 100 мл набухшей сефарозы промывают на бюхнеровской воронке 3—4 объемами деионизованной воды и суспендируют с медленным перемешиванием (как. в предыдущем методе) в 50—70 мл воды. Добавляют 10 мл бмс-окси-рана и 30 мл 2 М раствора NaOH, содержащего 0,2 г NaBH . Суспензию перемешивают в течение ночи при комнатной температуре под тягой, затем гель тщательно промывают деионизованной водой п переносят в колбу с буфером для посадки лиганда. Другие авторы рекомендуют несколько иное соотношение тех же реагентов [Uy, Wold, 1977]. [c.351]

Ковалентную посадку денатурированной ДНК на целлюлозу недавно было предложено осуществлять с помощью эпокси-активации носителя 1,4-бутандиолдиглицидиловым эфиром. Активацию целлюлозы проводили по такой же схеме, как описано выше для сефарозы. 1 г целлюлозы ( ellex 410 фирмы Bio-Rad ) промывали [c.389]

Активация сефарозы. Сефарозу 4В промывают на стеклянном фильтре (типа G-3) 10-кратным объемом 0,1 М На-фосфата (pH 11), затем бидистиллированной водой до нейтральных значений pH. Слегка подсушенную на фильтре током воздуха сефарозу взвешивают и заливают 1 М К3РО4 (pH И) 1 мл на 1 г сефарозы. К полученной суспензии, предварительно охлажденной до 4° С, добавляют при постоянном перемешивании раствор Br N в воде (5%) или в диоксане (20%) из расчета 5 мг Br N на 1 г сефарозы. После 7-минутной инкубации суспензию сефарозы переносят на стеклянный фильтр и быстро промывают сначала 20-кратным объемом охлажденной бидистиллированной воды, затем 20-кратным объемом 0,1 М На-фосфата, содержащего [c.297]

Иммуносорбенты на основе иммобилизованной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из дрожжей получают при степени активации сефарозы 150 мг Br N на 1 г геля. [c.298]

Лактатдегидрогеназу, используемую для регенерации кофактора, и фосфоглицераткиназу иммобилизуют при степени активации 50 и 30 мг Br N на 1 г геля сефарозы. [c.298]

М мочевине, затем удаляют денатурированные и перешедшие в раствор субъединицы и определяют содержание белка до и после обработки. Используя препараты Br N-активированной сефарозы, полученные при разной концентрации Br N, можно показать, что в зависимости от степени активации сорбента изменяется число субъединиц фермента, вовлеченных в ковалентную связь с матрицей. [c.300]

Препараты сефарозы с глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназой, иммобилизованной при разной степени активации, помещают в колонки (размер 0,5x3 см) и уравновешивают 0,15 М раствором Na I. Затем при комнатной температуре через колонки пропускают антисыворотку до полного насыщения иммуносорбента антителами (т. е. до прекращения адсорбции антител на сорбенте при пропускании дополнительных порций антисыворотки). Иммуносорбент отмывают от балластных белков 0,15 М раствором Na l до исчезновения поглощения при длине волны 280 нм в элюате. [c.304]

Неподвижная фаза в А. х. представляет собой специально получаемый сорбент, построенный обычно по схеме носитель-соединяющее звено ( ножка )-специфич. лиганд. Носителем служит чаще всего сефарозапроизводное агарозы, имеющее поперечные сшивки. Присоединение к ней лиганда или ножки , содержащих, как правило, аминогруппу, осуществляется после активации сефарозы бромцианом [c.221]

Для хроматографии рибосомальной РНК и для выделения плазминогена ]1роизводится лизин—сефароза 4В путем связывания ь-лизина с сефарозой 4В после активации бромцианом. Концентрация связанного лизина составляет 4—5 мкмоль на 1 мл набухшего геля. Лизин—сефароза 4В поставляется в виде лио-филизованного норощка пакетах по 15 г, что эквивалентно 60 мл набухшего геля. Порошок содержит добавки для сохранения способности геля к набуханию. При хранении сухого геля при температурах <8°С не наблюдается никакой заметной потери связанного лиганда даже через 1 год хранения. [c.141]

Ряд алкилагароз со структурой СНз(СН2)пМН—сефароза (где п принимает значения от О до 7), и-аминоалкилагароз со структурой ЫН2(СН2)п ЫН—сефароза (где п — от 2 до 8) характеризуется близким содержанием алкильных боковых цепей на гранулу геля [15, 49]. В одинаковых условиях (pH, ионная сила, состав буферного раствора и температура) способность СНз(СН2)пЫН—сефарозы удерживать фосфорилазу Ь зависит от длины углеводородных цепей. При хроматографии на производных сефарозы (я = 0 или 1) фосфорилаза Ь выходила из колонки с фронтом растворителя при п = 2 происходила задержка фермента, а при п = 3 фермент адсорбировался. Элюирование фосфорилазы Ь с модифицированной сефарозы (п = 3) возможно с помощью деформирующих буферных растворов, которые, как было показано, приводят к обратимым структурным изменениям фермента. На производном сефарозы с л = 5 связывание фосфорилазы было настолько сильным, что фермент не элюировался с колонки, даже когда pH деформирующего буферного раствора понижался до 5,8, хотя деформирующая способность такого буфера намного выше. Освободить фосфорилазу Ь из комплекса с этим производным можно только в неактивной форме после промывки колонки 0,2 М уксусной кислотой. Сама агароза содержит отрицательные заряды, а связывание алкил- или ариламинов на активированной бромцианом агарозе вводит в гель положительные заряды (разд. 8.2.4). В связи с этим йост и др. [28] обращали внимание на то, что на сефарозе с алкиламинами, прикрепленными после предварительной активации носителя бромцианом, связывание белков происходит большей частью при pH выше изоэлектрической точки выделяемых белков. Поэтому допускалось, что в этих случаях электростатические взаимодействия с положительно заряженной Ы-замещенной изомочевиной более существенны для связывания, чем гидрофобные взаимодействия с гидрофобной боковой цепью. Тем не менее гранулы агарозы не связывают фосфорилазу Ь, пока к ним не будут прикреплены алкильные боковые цепи некоторой минимальной длины. Кроме того, отмеченные выше заряды в равной мере присутствуют во всех членах гомологического ряда, и, следовательно, они не могут быть причиной различий в степени [c.152]

В работе Лоу и др. [42] сопоставлены свойства сорбентов на основе целлюлозы и сефарозы, для чего использовались экспериментальные кривые титрования 6-аминогексил-МАО+—сефарозы, немодифицированной сефарозы, 6-аминогексаноил — сефарозы и соответствующих производных целлюлозы (рис. 8.1). Очевидно образование ионизирующих групп после активации бромцианом это было также показано в случае целлюлозы, когда для реакции присоединения использовали дициклогеисилкарбодиимид [38]. Отклонение, наблюдаемое для сефарозы, существенно меньше, [c.180]

Требуемое количество геля замачивают для набухания в 10 М соляной кислоте 10 М соляную кислоту используют также для промывки геля в течение 15 мин. 1 г лиофильно высушенного геля набухает до объема 3,5 мл. Гель рекомендуется промывать в несколько приемов, используя на 1 г сухого геля 200 мл раствора. Сразу же после промывки добавляют раствор аффинного лиганда, который необходимо привязать к сефарозе. Оптимальные условия для связывания аффинного лнганда (pH, состав буфера и температура) зависят до определенной степени от характера лиганда. Как правило, реакция связывания наиболее эффективна при pH 8—10, но можно использовать и более низкие значения pH, если этого требует природа связываемого лигапда. Аффинный лиганд присоединяется в достаточных количествах даже и при этих pH, если увеличить количество бро.мциана при активации и количество лиганда при связывании. Аффинный ли1анд, в особенности белкового характера, растворяют в буфере с высокой ионной силой (около 0,5) для предотвращения неспецифической адсорбции. Высокая ионная сила облегчает затем последующую промывку.. Можно использовать карбонатный и боратный буферы с добавка.ми хлорида натрия. [c.190]

Взаимодействие между миозином и актином, на котором основано превращение химической энергии в механическую энергию в мышце, изучено Боттомлн и Трейером [138]. Исследовалось влияние ионной силы на специфическое и обратимое связывание тяжелого меромиозина и миозинового субфрагмента 1 на сефарозе с иммобилизованным G-актином. Комплексы, образуемые между производными миозина и иммобилизованным G-актином, могут диссоциировать при низких концентрациях АТР и ADP и пирофосфатов как в ирисутствии, так и в отсутствие Mg +. Кроме того, и связанный с сефарозой, и свободный G-актин лишь немного увеличивают Мд-+-стимулируемую АТРазную активность миозина. Такой подход позволяет решить вопрос, обязательно ли комилек-сообразование между миозином и актином приводит к активации АТРазы. [c.376]

Отмытую И декантированную сефарозу суспендируют в дистиллированной воде (1 1). Работу ведут под тягой. В суспензию сефарозы погружают электроды рН-метра и при постоянном перемешивании прибавляют к ней небольшими порциями бромциан (50—300 мг на 1 мл набухшей сефарозы). Добавляя раствор гидроксида натрия, pH суспензии поддерживают примерно около И. Для 5—10 мл сефарозы и 1—3 г бромциана рекомендуется 2М раствор гидроксида натрия, для 100—200 мл сефарозы и 20—30 г бромциана — 8М его раствор. Температура должна быть равна примерно 20 °С если необходимо охлаждение, добавляют лед. Реакция заканчивается через 8—12 мин. Далее Куатреказас рекомендует добавить большое количества льда и быстро перенести суспензию в воронку Бюхнера. Активированную сефарозу промывают при постоянном отсасывани предварительно охлажденным буферным раствором того же состава, который используют при последующем связывании аффинного лиганда. Объем буферного раствора, расходуемый на промывку сефарозы, должен в 10—15 раз превышать объем раствора, в котором проводилась активация сефарозы. Промытую сефарозу как можно быстрее суспендируют в равном объеме раствора аффинного лиганда. Связывание ведут при постоянном перемешивании при пониженной температуре (4°С) в течение 16—20 ч. Согласно данным Куатреказаса [14], промывка, добавление раствора аффинного лиганда и смешивание не должны длиться более 90 с. Даже при пониженной температуре активированная сефароза неустойчива. Связывание аффинного лиганда с активированной бромцианом сефарозой более подробно рассматривается в лоследующих разделах. [c.17]

Изменяя соотношение концентраций исходных мономеров, можно в широких пределах изменять пористость, удельную поверхность и число активных гидроксильных групп сферона. Структура твердого макросетчатого геля сферона похожа на структуру силикагеля (гидрофобные углеводородные группы обращены внутрь полимера). В то же время наличие гидроксильных групп на поверхности придает матрице сходство с сефарозой и позволяет использовать разработанные для сефарозы методы активации носителя Типы гелей сферой , содержащих различные функциональные группы, выпускаемые фирмой La hema (ЧССР), приведены ниже [c.24]

Довольно сложная схема активации сефарозы с целью введения реакционноспособных диазогрупп предложена О. Икедой и С. Фукуи (1973) [c.31]

Добавляют КДИ (0,12 г). Реакционную смесь из сефарозы и КДИ можно оставить на 0,25—6 ч в зависимости от времени проведения последующих стадий промывания и присоединения, причем выходы реакции идентичны в указанных интервалах времени. Это отличает данный метод активации от NBr-метода, при котором необходимо проводить стадию присоединения как можно быстрее. Кроме того, степень активации можно значительно увеличить при использовании большего количества КДИ. [c.63]

Активация матриц. Бисоксирановая активация сефарозы 6В осуществляется по методике, предложенной Поратом и Сандбергом [1]. [c.131]

Смотреть страницы где упоминается термин Сефароза активация: [c.349] [c.349] [c.356] [c.368] [c.389] [c.396] [c.419] [c.296] [c.297] [c.301] [c.75] [c.141] [c.157] [c.188] [c.190] [c.198] [c.206] [c.384] [c.12] [c.217] [c.191]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология