Эффективность процедуры клонирования

TAR-клонирование способно сушественно ускорить выполнение программы Геном человека . Напомним, что анализ геномов начинается с создания банков генов отдельных хромосом, выделение которых является очень трудоемкой задачей. Оказалось, что с помощью TAR-векторов можно селективно клонировать ДНК человека из суммарной ДНК межвидовых гибридов соматических клеток (см. гл. 5). содержащих одну человеческую хромосому. Эта процедура позволяет обогащать человеческую ДНК в 3000 раз. Более того, на примере гена BR A2, мутации в котором с высокой вероятностью приводят к появлению рака молочной железы, была продемонстрирована эффективность TAR-клонирования и для выделения специфических последовательностей из геномной ДНК человека (Larionov et al., 1997) С этой целью был сконструирован кольцевой TAR вектор, который при линеаризации содержал на одном конце промотор гена BR A2, а на другом — его дистальную часть. Стандартные операции кольцевого TAR-клонирования позволили за неделю работы впервые изолировать этот ген из геномной ДНК. [c.361]

Эффективность процедуры клонирования [c.51]

П. Эффективность клонирования в мягком агаре с использованием системы двойного агарового слоя. Приведенная процедура использует 1-часовой период обработки лекарством и требует четырех повторов на каждую экспериментальную точку. [c.282]

Принцип методики ПЦР ясен из рис. 5-89, В. В каждом цикле реакции необходимо сначала кратковременное нагревание ДНК для разделения двух цепей двойной спирали (1-й этап) Последующее охлаждение ДНК в присутствии большого избытка двух упомянутых ДНК-олигонуклеотидов приводит к специфической гибридизации этих олигонуклеотидов с комплементарными последовательностями ДНК (2-й этап). После отжига смесь инкубируют с ДНК-полимеразой и четырьмя дезоксииуклеозидтрифосфатами, в результате чего избирательно синтезируются те участки ДНК, которые располагаются книзу от затравки (3-й этап). Для эффективной амплификации ДНК требуется от 20 до 30 циклов реакции В каждом последующем цикле количество ДНК по сравпепию с предыдущим циклом удваивается Отдельный цикл занимает около 5 мин, поэтому при автоматизации всей процедуры для бесклеточпого молекулярного клонирования какого-либо фрагмента ДНК требуется несколько часов, гогда как обычные процедуры клонирования растягиваются на несколько дней [c.341]

Оценка эффективности экспрессии клонированного гена и анализ ее закономерностей в ряде случаев требует концентрирования белкового продукта в среде. Этой цели отвечает процедура ультрафильтрации, разработанная фирмой Ami on. [c.234]

Аликвоты наращивают до стадии стационарной культуры каждая из них содержит независимые клоны провирусной ДНК, имеющей в своем составе ген neo. Описанная процедура клонирования требует использования компетентных бактерий, обеспечивающих высокую эффективность трансформации (по меньщей мере 2-10 мкг), в количествах, позволяющих получить 2-10 трансформантов. Однако высокоэффективная канамициновая селекция в жидкой среде делает отбор клонов относительно несложным. Подробно этот метод описали Браун и др. [12]. [c.301]

На первый взгляд разработка любой эукариотической системы экспрессии представляется относительно простой процедурой, состоящей в подборе соответствующих регуляторных последовательностей, встраивании их в вектор в определенном порядке и клонировании гена-мишени таким образом, чтобы обеспечивалась его эффективная экспрессия. На практике же создание первого поколения эукариотических экспрессирующих векторов оказалось весьма кропотливым делом, основанным на методе проб и ошибок. До появления работы Муллигана, Хоуарда и Берга [c.146]

Процедура заключается в вьщелении нормального гена и его клонировании с использованием методов, которые обсуждались раньше в этой главе. Чтобы ввести ген в соответствующие клетки человека, понадобится безопасный и эффективный вектор. Клетки, по-видимому, нужно сначала вьщелить из организма, исправить, а затем вернуть на место. Это довольно просто сделать в случае болезней крови, таких как серповидноклеточная анемия, поскольку кроветворные клетки легко удалить из костного мозга и вернуть в организм. Самая важная проблема — убедиться в том, что исправленный ген нормально экспрессируется. Если такой ген не способен нормально включаться и выключаться, это может привести к более тяжелым проблемам, чем те, которые имеются, например, в случае образования слишком большого количества продукта. Ситуация оказывается еще более сложной, если болезнь вызвана доминантным геном. В этом случае доминантный ген также должен быть удален или инактивирован, а методы для этого пока не разработаны. [c.263]

Рис. 4-71. Использование гибридизации нуклеиновых кислот для определения участка клонированного фрагмента ДНК, который транскрибируется в мРНК. Данный метод предполагает обработку нуклеазой, расщепляющей цепи ДНК, не спаренные с комплементарной цепью РНК Этот метод позволяет точно выявлять начало и конец молекулы РНК. Аналогичные процедуры эффективны и для определения расположения нитронов

Для клонирования пео-содержащих провирусов предложены две упрощенные методики каждая из них предполагает селекцию искомого клона в клетках . oli на устойчивость к канами-цину. Одна из методик представляет собой модифицированную процедуру спасения маркера и предусматривает прямое клонирование провируса в плазмидном векторе. Другая методика, гораздо более эффективная, требует применения специальных ретровирусных челночных векторов, описанных в разд. 9.3.2.4. [c.300]

Одно из преимуществ описываемой процедуры получения трансгенных мышей по сравнению с другими методами состоит в том, что любую клонированную ДНК (в лямбоидном, плазмидном или космидном векторе) можно ввести в зиготу, где она интегрируется в геном и оказывается включенной в формирование зародышевого пути. Дополнительные манипуляции, такие, как переклонирование в специальные векторы и получение вирусных препаратов, здесь не требуются. Следует, однако, подчеркнуть, что эффективность микроинъекции в большой степени зависит от качества и свойств вводимой ДНК [15J. Ниже мы рассмотрим этот вопрос подробнее. [c.341]

Векторы pNA — пока единственные линейные прокариотические векторы. При клонировании больших фрагментов ДНК линейные векторы обладают преимуществом перед кольцевыми векторами, так как эффективность образования рекДНК в этом случае выше (Янковский, 1989). В то же время следует учитывать, что в процедурах выделения большие линейные молекулы ДНК более ломки, чем кольцевые. [c.223]

Одной из первых опубликованных работ, где было осуществлено секвенирование двух клонированных в векторе М13 фрагментов ДНК, полученных путем амплификации с использованием Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I в качестве фермента, была статья Шарфа и соавт [S harf et al., 1986]. Чтобы упростить процедуру лигирования, последовательности праймеров, используемые в их работе, несли в своей 5 -области сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз, но, несмотря на это, эффективность клонирования составила только 1%. Далее полученные клоны секвенировали обычным дидезокси-методом. [c.138]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология