Получение сферопластов

Единственным методом введения гибридных плазмид является трансформация сферопластов, полученных после обработки клеток лизоцимом. Клеточная стенка должна быть при этом подготовлена предварительным выращиванием клеток на среде с пенициллином и глицином. Для каждого штамма требуется оптимизация условий получения сферопластов и их регенерации. В лучших экспериментах частоты трансформации достигают 10 —10 трансформантов на 1 мкг ДНК. [c.174]

В большинстве экспериментов для выделения и определения внутриклеточных компонентов применяют различные методы разрушения микроорганизмов. Это могут быть ручные и механические гомогенизаторы, растирание клеток с абразивами, растирание замороженных клеток, перемешивание биомассы со стеклянными бусами. Наиболее полное разрушение клеток достигается в случае применения декомпрессионных методов (Х-пресс,Френч-пресс) или ультразвука. Реже применяют осмотический шок и метод замораживания-оттаивания. Описаны также комбинированные методы разрушения микроорганизмов, сочетающие обработку клеточных стенок ферментами с последующим осмотическим шоком полученных сферопластов (протопластов) или растиранием их в гомогенизаторе. [c.133]

Не менее своеобразны и не традиционны принципы получения другого важнейшего представителя второго поколения газонаполненных пластмасс, обладающих очень высокими прочностными показателями, — синтактных пенопластов, или сферопластов. Данные материалы относятся к физическим пенам , так как ячеи-6 [c.6]

Следствием существенных различий структуры клеточной оболочки у грамположительных и грамотрицательных бактерий является получение разных образований под действием агентов, нарушающих синтез пептидогликана. Например, под действием пенициллина из грамположительных клеток образуется протопласт, не несущий оболочки, а из грамотрицательных — сферопласт, имеющий остатки оболочки на поверхности клетки. Клетки, утерявшие клеточную стенку в результате мутации или разрушающего воздействия, называются также L-формами и могут существовать только в изотонических растворах. [c.41]

Раствор используется для получения дрожжевых сферопластов. [c.63]

Для получения сферопластов дрожжей суспензии их клеток могут быть подвергнуты лизису с помощью препарата ферментов, выделенных из содержимого желудка виноградной улитки. Такой улиточный фермент в течение короткого времени при 37—40° лизирует, например, клеточную стенку дрол жей рода Sa haromy es. Препарат фермента готовят и лаборатории из свежесобранных улиток и хранят в замороженном состоянии, используя по-потребности. [c.137]

I буфере В (10 мг/мл), инкубировать от 10 до 45 мин при комнатной емпературе до превращения 85—90 % клеток в сферопласты (за далением клеточной стенки необходимо проследить под фазово-юнтрастным микроскопом, поскольку для разных штаммов Е. соН штимальное время обработки лизоцимом, особенно в указанных убоптимальных по значению pH условиях, может существенно раз-[ичаться при этом чрезмерная обработка лизоцимом может повре-[ить протопласты) эта стадия — получение сферопластов — [вляется ключевой. [c.215]

Прокариоты без клеточной стенки. При воздействии определенными химическими веществами оказалось возможным получать в лаборатории из разных видов прокариот формы с частично (сферопласты) или полностью (протопласты) отсутствующей клеточной стенкой. Впервые это обнаружили при действии на бактериальные клетки лизоцимом, ферментом из группы гликозидаз, содержащимся в яичном белке, слезной жидкости и выделяемом некоторыми бактериями. Было выяснено, что лизоцим разрывает 3-1,4-гликозидные связи, соединяющие остатки Ы-ацетилглюкозамина и К-ацетилмурамовой кислоты в гетерополисаха-ридной цепи (рис. 1.3), что в конечном итоге может привести к полному удалению пептидогликана из клеточной стенки. Полученные под действием лизоцима сферопласты (из грамотрицательных прокариот) или протопласты (из грамположительных) принимают сферическую форму [c.18]

Добавьте 6 мл верхнего агара —Leu top (расплавленного и охлажденного до 45 °С), быстро перемешайте и немедленно вылейте на чашку —Leu+Sorb . Нужно стремиться к тому, чтобы время воздействия на сферопласты повышенной температуры (45 °С) было минимально коротким. После того как верхний агар застынет, инкубируйте чашки при 30 С. Чтобы определить эффективность трансформации или эффективность регенерации, приготовьте серийные разведения суспензии, полученной на стадии 7, в 1 М сорбитоле и высейте в верхнем агаре + 1еи> на чашки + eu4-sorb (20 мкг/мл лейцина). [c.228]

Этот раствор используется для получения дрожжевых сферопластов. Приготовьте в указанной концентрации раствор зимолиазы в стерильном 10 мМ N32HP04 (pH 7,5)+50%-иый глицерин. [c.63]

У бактерий, как и у животных клеток, плазматическая мембрана обладает свойством избирательной проницаемости и, таким образом, может повышать концентрацию веществ в клетке, увеличивая осмотическое давление до 20 10 кПа (20 атм). Плазмалемма одна не могла бы выдержать такое давление, не опираясь на клеточную стенку. Поэтому, если удалить стенку, в гипертон ических растворах мембрана со временем разрывается. Если резко понизить концентрацию раствора, в котором находятся протопласты, клетки лопаются и их содержимое вытекает раствор, причем плазматическая мембрана остается в виде пустого мешка . Это наблюдение и легло в основу метода получения плазматических мембран бактерий. В отличие от протопласта, термин сферопласт применяется для бактериальных клеток с частично разрушенной клеточной стенкой. [c.11]

При получении протопластов и сфероплас-тов большое значение имеет подбор условий, обеспечивающих в последующем эффективную регенерацию клеточных стенок. Процедуры получения протопластов и сферопластов, трансформации их молекулами ДНК, регенерации клеточной стенки и отбора колоний трансформантов многоэтапны, а результат зависит от многих параметров состава растворов, способов обработки и др. Все это приводит к тому, что данные методики отличаются низкой воспроизводимостью, требуют высокой квалификации исполнителя и весьма трудоемки. Поэтому по мере разработки более простых способов данный подход постепенно утратил свое значение. На смену пришли методы обработки клеток растворами солей (см. 2.1). [c.33]

Хотя ЭДТА-лизоцимные сферопласты Е. oli в некоторых эксп иментах могут обеспечивать высокую эффективность трансфекции фаговыми ДНК (до 10 3 бое на молекулу ДНК фага А), процесс их получения многостадиен и дает плохо воспроизводимые результаты. Поэтому данный методический подход не нашел широкого применения. Начиная с 1970 г его почти полностью вытеснил метод СаСЬ-зави-симой трансфекции клеток Е. соН, который разработали М. Мандель и А. Хига. Они обнаружили, что обработка культуры Е. соИ раствором СаСЬ на холоде (О °С) с последующим тепловым шоком (37 °С) приводит к поглощению клетками добавленных в среду молекул ДНК фага А и завершается образованием инфекционного фагового потомства. Метод оказался крайне простым и воспроизводимым. Наиболее эффективно компетентность индуцируется в активно делящихся клетках Е. соИ. Разработан ряд модификаций данного метода, повышающих эффективность трансфекции клеток фаговыми ДНК. [c.83]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология