Получение ферментных конъюгатов

Получение ферментных конъюгатов [c.304]

Ковалентные методы получения иммуноферментных конъюгатов нашли весьма широкое распространение, однако в некоторых случаях действие сшивающего реагента отрицательно сказывается на ферментативной и иммунологической активности компонентов гибридной макромолекулы. В связи с этим определенный интерес представляют иммунологические методы введения ферментной метки. [c.112]

Основной проблемой, стоящей особенно остро при введении ферментной метки в низкомолекулярные соединения, является доступность антигенных детерминант в образовавшемся конъюгате для взаимодействия с антителами. При использовании меченых гаптенов необходимо, чтобы связь маркера с ним осуществлялась через ту же функциональную группу, которая модифицировалась для синтеза конъюгата белок — гаптен для целей иммунизации и получения антител. Это накладывает дополнительные требования на выбор фермента-маркера. Кроме того, разделение конъюгата гаптен — фермент от несвязавшегося фермента, примесь которого может оказывать негативное влияние на результаты анализа, крайне затруднительно. Другим существенным условием получения меченых гаптенов является доступность очищенного антигена в значи-гельном количестве, что осуществимо далеко не всегда. [c.100]

При использовании ферментных меток химическая структура меченого антигена может существенно отличаться от немеченого (так, например, могут быть получены конъюгаты с различным мольным соотношением антиген/фермент). В этих случаях полученные значения констант свя- [c.160]

Наибольшее распространение получили методы введения ферментной метки, основанные на образовании ковалентной связи между молекулами антитела и фермента. Наибольшее практическое применение нашел метод получения иммунопероксидазных конъюгатов окислением углеводного компонента фермента перйодатом натрия. В случае использования щелочной фосфатазы в качестве фермента-маркера применяют глутаровый альдегид, взаимодействующий с е-аминогруп-пами белковых молекул. [c.317]

Стабильность иммуноферментных конъюгатов при хранении— важнейший параметр, обусловливающий возможность их практического использования. Методы направленной стабилизации конъюгатов пока еще не разработаны. Не существует также корреляции между стабильностью конъюгатов и методом их получения. Однако вь1сокая стабильность гибридных молекул обеспечивает их применение на практике и значительно превосходит стабильность антител и антигенов, меченных радиоактивными изотопами. В лиофилизованном состоянии ферментные конъюгаты сохраняют свои свойства до двух лет. Стабильность при хранении в растворе (+4°С) более года отмечена для конъюгатов с щелочной фосфатазой, р-галактозидазой, лизоцимом, пероксидазой. [c.113]

Возможность применения ферментов в качестве метки в иммуно анализе обусловлена, прежде всего, их высокой каталитическо активностью, позволяющей с применением соответствующих суб стратных систем регистрировать ферменты в растворе на уррвн( 10-15 д ниже. Благодаря широкому развитию методов энзимоло ГИИ принципиально решена проблема введения ферментной метки I молекулы антигенов и антител, что позволяет в настоящий момент легко осуществить связывание молекул ферментов с другими соеди нениями с целью получения соответствующих конъюгатов. [c.78]

Методика анализа предусматривает смешивание образца с ферментным конъюгатом, погружение индикаторной полоски полученную смесь, инкубацию в течение 5 мин при воздействии ультразвуком и проявление с помощью цветных реакций в тече- ние 10 мин (см. раздел Материалы и методы ). При первой инкубации антиген одновременно связывается с иммобилизован-ными антителами и с конъюгатом антител и фермента. Окраши< вание в результате проявления происходит по тому же механизму, что и в описанном выше анализе Тйорфия. Однако в отличие от этого конкурентного анализа интенсивность окраски в двухцентровом сэндвич-методе пропорциональна концентрации антигена. [c.145]

При выполнении анализа образец, содержащий антиген, добавляют к ферментному реагенту и какое-то время перемешивают, Затем край индикаторной полоски погружают в полученную смесь ферментного реагента с раствором антигена и дают жидкости подняться по полоске под действием капиллярных сил. На этом этапе полоска поглощает ограниченное и воспроизводимое количество раствора. Антиген и ферментный конъюгат, перемещаясь по полоске, иммунологически связываются с иммобилизо- [c.150]

Готовят растворы двух препаратов инсулина в концентрации 100 мкг/мл и раститровывают в микропланшете для ИФА в концентрациях от 10 мкг до 5-10-5 мкг в лунку. Инкубируют в течение ночи при 4°С, тщательно отмывают. В лунки вносят раствор антител к свиному инсулину в концентрации 10 мкг/мл по 100 мкл. Инкубируют в течение часа при 37 °С, тщательно отмывают. Вносят конъюгат антимышиных антител с ферментной меткой и инкубируют в течение часа при 37 °С. Тщательно отмывают и вносят соответствующий субстрат (с. 319). Через 30 мин определяют величину оптической плотности при соответствующей длине волны (с. 320). Строят графики зависимости величины оптической плотности от разведения антигена. Полученные графики должны свидетельствовать о том, что специфичность связывания антител к свиному инсулину значительно выше по сравнению со связыванием бычьего инсулина, хотя в последнем случае и наблюдается специфическое связывание. Такой результат свидетельствует [c.327]

Ферментативный иммунохроматографический метод. Добавляют 10—20 мкг образца (буферного раствора, сыворотки или цельной крови) к 1 мл ферментного реагента (приготовленного на 0,1 М натрий-фосфатном буфере, pH 7,0 и содержащего 0,2 моль хлорида натрия 0,2—1,0 мг конъюгата [теофиллин — пероксидаза] 100 мг глюкозооксидазы 2 г неиммунных IgG барана). В полученную смесь погружают край индикаторной полоски (4x90 мм), содержащей иммобилизованные антитела против теофиллина ( 30 мкг/см ),и дают растворителю подняться за счет капиллярных сил до противоположного края полоски (на это уходит 10 мин). Переносят полоску в проявитель (приготовленный на 0,01 М натрий-фосфатном буфере, pH 7,0, и содержащий в 1 л 0,02 моль хлорида натрия 0,5 г тритона QS-44 400 мг 4-хлорнафтола 0,05 моль глюкозы 2 г бычьего сывороточного альбумина). Через 5 мин на бумаге появляется голубая окрашенная область в форме ровной полосы или ракеты. Высота окрашенной области пропорциональна концентрации определяемого вещества. Для количественного анализа предварительно строят калибровочную кривую, отражающую зависимость высоты окрашенного фронта от концентрации теофиллина. [c.135]

Данные, полученные на модельной системе и представленные на рис. 18-3—18-5, подтверждают принципы, положенные в основу метода ИФАЯМ. Метод по существу представляет собой вариант иммуноферментного анализа с разделением компонентов, в котором связывание антител с лигандом, входящим в состав конъюгата [лиганд — фермент — якорь], препятствует взаимодействию якорных остатков конъюгата с иммобилизованным рецептором. С последним связывается только избыток свободного конъюгата, что позволяет удалить его из раствора и отдельно протестировать содержание ферментной метки как в растворе, так и в нерастворимой фракции. [c.281]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология