РНК-полимеразы выбор фермента

Сразу же, как только стало ясно, что функции РНК-полимеразы подразделяются между минимальным ферментом, ответственным за элонгацию синтезирующейся РНК, и сигма-фактором (а-фактором), участвующим в выборе промотора, возник вопрос о возможности существования нескольких типов сигма-факторов, специфичных для разных классов промоторов. Как правило, такой механизм сам по себе, по-видимому, не используется для контроля транскрипции у бактерий. Но при определенных обстоятельствах в жизненном цикле бактериальной клетки происходят коренные изменения. При этом наблюдается выключение транскрипции ранее экспрессируемых генов и включение новых транскрипционных единиц. В этих случаях, возможно, происходит введение долговременных изменений непосредственно в РНК-полимеразу. [c.157]

Следует отметить, что, несмотря на довольно большой выбор ферментов и соответствующих меченых нуклеотидов для мечения фрагментов ДНК по 3 - или 5 -концам, наиболее часто используемыми являются варианты с применением полинуклеотидкиназы фаза Т4 для мечения 5 -выступающих концов и Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I для мечения 3 -углубленных концов ввиду более высокой эффективности и относительной простоты данных процессов. Дополнительным удобством является то, что Кленовский фрагмент ДНК-полимеразы I хорошо работает в большинстве рестрикционных буферов, и, таким образом, реакции расщепления и последующего мечения можно проводить в одной пробирке и даже совместно, что впрочем нежелательно из-за все-таки имеющейся 3 —> 5 -экзонуклеазной активности у этой ДНК-полимеразы. [c.24]

В автоматическом секвенировании ДНК применяются различные высокопроцессивные ДНК-полимеразы. Выбор конкретной из них во многом зависит от температурных особенностей проводимых терминирующих реакций. Следует отметить, что весьма широкое применение для секвенирующих реакций, проводимых с помощью биоробота, находит фермент Bst ДНК-полимераза из-за ее высокой стабильности при комнатной температуре в отличие от секвеназы. Так, в ряде работ показано высокое качество получаемых результатов при использовании этого фермента для проведения секвенирующих реакций с помощью лабораторного робота [Earley et al., 1993 1994]. В последней работе авторами было проведено сравнение двух ДНК-полимераз - секвеназы и [c.311]

Каким образом клеткам удается достичь столь высокой степени точности в выборе нуж ного основания в процессах репликации и транскрипции, а также при спаривании кодона с антикодоном в процессе синтеза белка В ранних работах исследователи часто высказывали мнение, что специфичность спаривания оснований определяется исключительно образованием двух (или соответственно трех) водородных связей и стабилизацией за счет взаимодействия соседних участков спирали. Оказалось, однако, что свободная энергия образования пар оснований мала (гл. 2, разд. Г, 6), а дополнительная свободная энергия, обусловленная связыванием основания с концом уже существующей цепи, не в состоянии обеспечить специфичность спаривания. Исходя из современных энзимологических данных, можно предположить, что важную роль в обеспечении правильности спаривания играет сам фермент. РНК- и ДНК-полимеразы — достаточно крупные молекулы. Следовательно, связывающее место фермента может полностью окружить двойную спираль. Если это так, то нетрудно представить себе, что лроцесс выбора основания может протекать так, как это показано на рис. 15-5. На приведенном рисунке изображено гуаниновое основание матричной цепи молекулы ДНК, расположенное в месте наращивания комплементарной цепи (ДНК или РНК) с З -конца. Для образования правильной пары оснований соответствующий нуклеозидтрифосфат должен быть пристроен до того, как произойдет реакция замещения, в результате которой нуклеотид присоединится к растущей цепи. Предположим, что у фермента есть связывающие места для дезоксирибозного компонента матричного нуклеотида и для сахарного компонента включающегося нуклеозидтрифосфата, причем эти места расположены на строго оцределенном расстоянии друг от друга. Как показано на рис. 15-5, в каждом связывающем [c.212]

Имеются доказательства того, что происходит симметричный, но сложный процесс непрерывной репликации на обеих цепях. Раскручиванию двунитевой ДНК способствует связывание с многочисленными белковыми частицами, которые прикрепляются к родительской ДНК в выбранном месте инициации н им удается оставить разделенными комплиментарные цепи ДНК, готовые для нового синтеза. Далее определенная РНК-полимераза синтезирует короткую РНК, длиной 01 20 до 25 нуклеотидов, которая комплиментарна родительской ДНК и связывается с ее цепью. Эта РНК действует как затравка для действия большого объемистого фермента ДНК-полимераза 1П, который теперь создает новую цепь ДНК длиной примерно в 1000 остатков, являющуюся продолжением этой РНК. Такой синтез идет в направлении 5 3 путем конденсации дезоксинуклеозид-5 -трифосфатов с З -концевой гидроксильной группой на обеих цепях родительской ДНК показано стрелками на схеме (3) . Поскольку фермент работает в условиях, близких к обратимости, это обеспечивает максимальный термодинамический контроль за правильностью выбора встраиваемых дезоксирибонуклеозидов путем спаривания их оснований с соответствующими основаниями в существующей цепи. Таким путем на каждой родительской пепи располагается ряд блоков, называемых фрагментами Оказаки. [c.199]

ДНК-зависимая РНК-полимераза. РНК-полимераза Е. соИ является мультимерным белком, состоящим из 5 субъединиц двух а, , , ст. Установлено, что -субъединица участвует в связывании с ДНК-матрицей, а-субъединица — в связывании рибонуклеозидтрифосфатов, ст-субъединица - в выборе участка инициации транскрипции. Весь комплекс субъединиц представляет собой холофермент РНК-полимераза без ст-субъединицы — кор-фермент. Каталитический участок фермента находится в кор-ферменте. В эукариотических клетках существует четыре типа РНК-полимераз в ядре — РНК-полимераза I (транскрипция рРНК), РНК-полимераза II (транскрипция мРНК), РНК-полимераза III (транскрипция тРНК), а также еще один тип в митохондриях (хлоропластах). [c.306]

Поэтому промотор для транскрипции 5S-PHK находится внутри самого гена между положениями -Ь 55 и + 80. Фрагмент, содержащий эту область, способен осуществлять инициирование транскрипции любой ДНК на расстоянии 55 п. н. перед сайтом своей интеграции. Каким же образом РНК-полимераза инициирует синтез РНК в области, предшествующей расположению своего промотора Наиболее предпочтительное объяснение состоит в том, что размеры фермента позволяют ему одновременно связываться с промотором и взаимодействовать с областью, отстоящей от него на расстояние 55 п. н. Так же как и в случае с РНК-полимеразой II, геометрия связывания фермента с промотором должна определять местоположение стартовой точки, но пиримидины при этом не могут быть использованы при инициации. Поэтому фермент обладает некоторой свободой при выборе ближайшего пурина, участвующего в инициации. Конечно, между ферментами существуют различия так, РНК-полимераза II танавливает контакт с точкой старта, расположенной от п мотора по ходу транскрипции, тогда как РНК-полимераза III связывается в противоположной ориентации (при условии, что промотор является местом связывания). [c.155]

Весьма подробно была изучена РНК-полимераза Е. соН. Ее основу образует так называемый кор-фермент, состоящий из четырех полипептидных цепей-двух идентичных субъединиц (а) и двух различных субъединиц ( и )- Кор-фермент катализирует рост цепи за счет присоединения рибонуклеозидтрифосфатов к З -концу синтезируемой молекулы РНК. Присоединение к кор-ферменту еще одной полипептидной цепи, называемой а-субъединицей, приводит к образованию холофермента РНК-полимеразы. а-Субъединица обеспечивает точное узнавание про-моторного участка и выбор одной из комплементарных цепей ДНК в качестве матрицы на стадии инициации транскрипции (рис. 11.3). После того как синтез РНК уже начался, происходит диссоциация а-субъ-единицы. Вместо нее с кор-ферментом соединяется другой белок-продукт гена nus А. Этот ферментативный комплекс продолжает транскрипцию вплоть до терминаторного участка, узнавание которого и обеспечивается белком nus А. Подробности молекулярного механизма терминации транскрипции окончательно неизвестны, однако есть основания полагать, что для высвобождения новосинтезированной цепи РНК из комплекса с РНК-полимеразой и ДНК кроме nus А необходим по крайней мере еще один белок, называемый р-фактором. [c.37]

Выбор конкретной ДНК-полимеразы зависит от целей эксперимента. Ферменты, обладающие более высокой точностью синтеза ДНК, и меньшей частотой включения в продукт ПЦР ошибочных (некомплементарных матрице) нуклеотидов, как правило, обладают 3 5 -экзонуклеазной (корректирующей) активностью. В том случае, если на 3 -конец строящейся цепи ДНК включается некомплементарный матрице нуклеотид, он удаляется из цепи с участием этой активности ДНК-полимеразы. К сожалению, наиболее широко распространенная в настоящее время Taq-ДНК-полимераза, такой активностью не обладает, а следовательно, точность синтеза ДНК этим ферментом невелика по сравнению с ДНК-полимеразами, способными корректировать собственные ошибки. К последним ферментам относятся, например, Pfu-, Vent- и Deep Vent-ДНК-полимеразы. [c.198]

Реакцию синтеза ДНК с участием ДНК-полимеразы (например в ПЦР) часто называют самовоспроизведением ДНК, а молекулу ДНК — единственной самовос-производящейся молекулой. В действительности самовоспроизведение — свойство гораздо более сложных систем. В самом деле, в репликации ДНК обязательно участие ДНК-полимеразы, причем этот фермент не только катализирует образование 3, 5 -фосфодиэфирной связи, но и определяет, наряду с ДНК-матрицей, правильный выбор очередного нуклеотида. Иначе говоря, ДНК не сама воспроизводится, а синтезируется аппаратом, содержащим ДНК-матрицу и белок ДНК-полимеразу. И эта двухкомпонетная система не самовоспроизводится, поскольку количество ДНК-полимеразы не увеличивается (наоборот — уменьшается в результате денатурации соответственно убывает скорость репликации). Для того, чтобы эта система самовоспроизводилась, ьгужен механизм синтеза ДНК-полимеразы. А для этого требуется наличие гена ДНК-полимеразы в ДНК-матрице, и еще множества генов, кодирующих белки, необходимые для экспрессии (транскрипции и трансляции) всех этих генов. Колоссальное усложнение системы Однако и это далеко не все. Многие вещества, необходимые для самовоспроизведения, нестабильны, и в пище практически отсутствуют, например ьгуклеозидтрифосфаты), следовательно должны быть механизмы их образования в самой системе, т. е. нужен метаболизм. А это значит, что требуется еще много генов и соответствующих белков. [c.188]

Механизм, с помощью которого ДНК-полиме-раза катализирует полуконсервативньгй синтез новых цепей ДНК, был описан в разд. 2.1.д. Цепи удлиняются путем последовательного присоединения нуклеотидов к праймеру со свободной З -гид-роксильной группой выбор нуклеотидного остатка на каждом этапе определяется ДНК-матрицей. ДНК-полимераза I Е. соН катализирует и некоторые другие важные реакции. Две из них имеют особое значение для эи периментов с рекомбинантными ДНК это 3 ->5 - и 5 ->3 -экзонуклеазные реакции. В обоих случаях образуются продукты с 5 -фосфо-моноэфирными концами. Две указанные экзонуклеазные активности присуши разным участкам молекулы ДНК-полимеразы I, которые можно разделить, обработав белок протеолитическими ферментами. После разделения обнаруживается, что 3 —>5 -экзонук11еазная и полимеразная активности связаны с большим по размеру полипептидом, содержащим карбоксильную фуппу на конце, а5 ->3 -экзонуклеазнаяактивность-со вторым, более мелким фрагментом. [c.222]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология