Твердофазное секвенирование ДНК

Рис. 75. Схема твердофазного секвенирования полипептида на примере фрагмента, полученного расщеплением бромцианом. Зачерненный, ква.драт - полимерный носитель ,

Рис. 2.7. Схема проведения твердофазного секвенирования ДНК

Эффективность последовательность в 20—30 аминокислот может быть установлена без особых затруднений как в жидкофазном, так и в твердофазном вариантах деградации. Таким образом, этот метод существенно не уступает автоматическим методам секвенирования. [c.424]

С помощью этого метода за короткий срок удалось установить полную нуклеотидную последовательность ДНК SV 40, рекомбинантной плазмиды pBR322 и многих других последовательностей ДНК. Однако секвенирование методом Максама-Гилберта имеет ряд недостатков, связанных с длительностью и значительной трудоемкостью процедур. В настоящее время на основе секвенирования с помощью химической деградации разработаны усовершенствованные и быстрые методы определения нуклеотидной последовательности, в том числе твердофазное секвенирование и секвенирование с использованием обращенно-фазовой хроматографии. [c.30]

Реакция с бромоцианом находит и иное нримененне. Пептидные фрагменты, полученные при расщеплении бромоцианом и несущие С-концевой гомосеринлактон, можно вводить в реакцию конденсации (с высоким выходом) с аминогруппами полимеров (34- 36). Этот метод позволяет избирательно фиксировать фрагменты через С-концевой аминокислотный остаток на нерастворимом носителе с целью твердофазного секвенирования [86]. [c.100]

Следует иметь в виду, что расщепление пептидной связи тирозина окислительным галогенированием обычно проводят в 50—80%-ной уксусной (или муравьиной) кислоте при комнатной температуре в течение нескольких часов по аналогии с расщеплением бромоцианом (разд. 2.4.1). Это довольно жесткие условия, при которых возможны побочные реакции, такие, как дезамидирование или расщепление лабильных пептидных связей (Asp-Pro). Фрагменты с С-концевым диоксоиндолилспи-ролактоном фиксируют ковалентно через 3-аминопропильную группу макропористого стекла с целью твердофазного секвенирования по Эдману [197]. [c.107]

Относительно недавно был предложен новый вариант твердофазного секвенирования ДНК с использованием магнитных частиц, покрытых стрептавидином [Ohara R., Ohara О., 1995]. Фрагменты ДНК, меченные биотином по 5 -концу с помощью ПЦР, сорбировались на данные магнитные частицы и подвергались реакциям химической модификации и после пиперидинового гидролиза наносились на секвенирующий гель. С помощью магнитных частиц достигалось быстрое и полное удаление реагентов, что не могло не привести к получению высококачественных результатов. [c.39]

Поскольку в основе метода ферментативного секвенирования лежит построение новой комплементарной цепи ДНК по уже имеющейся, то большое значение приобретает подготовка молекул ДНК для осуществления этого процесса. Так, если для метода секвенирования ДНК химической деградацией было необходимо наличие одно- или двуцепочечного фрагмента, нe 5ш eгo на одном (гомогенном) из своих концов единственную метку, то для секвенирования ферментативным методом необходимо наличие немеченной матрицы ДНК и при этом желательно одноцепочечной. Хотя, справедливости ради, следует отметить, что матрица ДНК, несущая какую-либо метку (включая и радиоактивную), в большинстве случаев не окажет заметного влияния на заключительный радиоавтограф из-за большой разницы в размерах самой матрицы и вновь синтезированной в условиях терминации цепи ДНК. Что касается матрицы ДНК, один из концов которой несет метку в виде молекулы биотина, то в этом случае возможна ее сорбция на твердой фазе, например, на магнитных частицах со стрептавидином и проведение так называемого твердофазного секвенирования. При этом выхода биотинилированной метки в заключительный раствор терминирующей смеси, содержащей комплементарную цепь ДНК, меченную уже как-то по-другому и предназначенную для нанесения на секвенирующий гель, даже не произойдет. [c.48]

Был описан интересный способ получения одноцепочечной матрицы ДНК, легший позднее в основу такого высокопроизводительного метода как твердофазное секвенирование (рис. 2.7) [Stahl et al., 1988]. В цитируемой работе фрагмент ДНК, меченный биотином, сорбировался на твердой фазе в виде авидин-агарозы. После этапов денатурации щелочью и последующей отмывки на оставшейся одной цепи ДНК, связанной через биотин-авидиновый комплекс с агарозой, отжигался секвенирующий праймер и шло построение комплементарной цепи ДНК Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы в условиях терминации. Затем еще один раунд щелочной денатурации приводил к высвобождению новосинтезированных цепей ДНК, пригодных для их разделения секвенирующим гель-электрофорезом. Справедливости ради следует отметить, что авторы в данной статье упоминают о принципиальной возможности повторения циклов отжига праймера и построения цепи по сорбированной матрице, что [c.56]

Еще одной важной особенностью твердофазного секвенирования биотинилированных цепей ДНК, сорбированных на магнитных частицах, является возможность использования этого подхода не только при прямом секвенировании ПЦР-продуктов, рассмотренном выше, но и в экспериментах по циклическому секвенированию ДНК. [c.152]

ФИТЦ препаратом, дающим окрашенные производные отщепляемых, аминокислот [Wilson et al., 1979]. Здесь нет возможности останавливаться на этих и других интересных усовершенствованиях процесса секвенирования белков, поскольку это выведет нас за пределы круга вопросов, рассматриваемых в книге. Нам также придется вовсе оставить в стороне вариант секвенирования в твердой фазе (с закреплением полипептида с одного его конца на твердом носителе), а также интересное предложение о создании газо-жидкостного твердофазного секвенатора с миниатюрной неподвижной камерой, в которой полипептид задерживается на стекловолокнистом фильтре fHewi k et al., 1981]. [c.514]

Был секвенирован один из клонов с наиболее короткой последовательностью ДНК, кодирующей эпитоп РАЬ204 в белке р68. Его аминокислотная последовательность была сопоставлена с последовательностью длиной 63 аминокислоты внутри большого Т-антигена, включающей эпитоп. Методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) изучали взаимодействие серии из четырех синтетических полипептидов, соответствующих этому участку, с РАЬ204. В результате было установлено, что эпитоп представляет собой участок длиной 17 амино- [c.201]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология