Амплифицированные последовательности

Селекция амплифицированных последовательностей генома [c.497]

Ниже мы рассмотрим детально лишь факторы, имеющие, по-видимому, важное значение для выбора стратегии экспрессии гена. Это стабильность амплифицированных последовательностей в отсутствие селекции, структура вектора и частота амплификации гена. [c.260]

Причины появления в одних случаях гомогенно окрашенных районов, а в других — DM пока неясны. По-видимому, конструкция вектора здесь не играет роли, а определяющее значение имеют природа клеток-хозяев и характеристика сайта первичней интеграции. Так, например, две наиболее часто применяемые линии клеток хомяка СНО и ВНК-21 обеспечивают преимущественно стабильную амплификацию гена, а у мышиных фибробластов и некоторых линий опухолевых клеток человека преобладает DM-форма [2]. Таким образом, если во главу угла ставить стабильность амплифицированных последовательностей в отсутствие селекции, то предпочтение следует отдать клеткам [c.260]

Праймеры для ПЦР обычно имеют длину 20 нуклеотидов. Можно синтезировать и более длинные затравки, но они редко бывают необходимы. К 5 -концу праймера можно присоединить последовательность, не комплементарную исследуемому образцу. Такие последовательности включаются в двухцепочечные продукты ПЦР, что обеспечивает возможность введения сайтов рестрикции [3] или регуляторных элементов (к примеру, промоторов в концы амплифицированных последовательностей [6]). Если о подлежащей амплификации последовательности имеется [c.179]

Оценить эффективность амплификации генов можно либо с помощью гибридизационных методов, позволяющих детектировать увеличение количества копий специфических последовательностей ДНК или мРНК, либо с помощью количественного анализа экспрессии белка. Наиболее информативно сравнение данных по всем трем контрольным параметрам (количества ДНК, РНК и белка), так как изменения этих параметров не всегда коррелируют друг с другом. Кроме того, полезную информацию может дать локализация амплифицированных последовательностей на метафазиых хромосомах с помощью гибридизации in situ например для оценки стабильности экспрессирующих клонов при культивировании в неселективных условиях. [c.262]

Интересная особенность строения генома актиномицетов — явление амплификации части генома. Амплифицированные последовательности (АП) имеют размер от 50 т. п. о. до примерно 0,2 т. п. о. и от 10 до 500 тандемно повторяющихся копий. В сумме они могут составлять до 30 % генома. По крайней мере в некоторых случаях повторяющаяся единица фланкирована прямыми повторами. Возможно, повторы имеют функции IS-элементов. Рекомбинация по прямым повторам может приводить к вариантам, имеющим отличную от исходной локализацию генов, расположенных между ними, вариантам с разным числом копий этих генов и полностью утратившим эти гены. Все это приводит к возникновению мутантных фенотипов. Возможно, это вторая причина помимо интеграции и вырезания плазмид, приводящая к реверсибильной и нереверсибильной генетической нестабильности у актиномицетов. [c.169]

Примерно десятую часть продуктов реакции амплификации исследуйте при помощи электрофореза в агарозном геле. Во многих случаях получается одна полоса, окрашенная бромистым этидием. Можно даже примерно рассчитать количество амплифицированной ДНК- Обычно при амплификации последовательности длиной 1 т. п. н. из 0,3 мкг геномной ДНК млекопитающих получают 1 мкг амплифицированной последовательности. При амплификации маленького фрагмента ДНК последовательно с двумя парами праймеров (внутренних и внешних) можно получить несколько микрограмм такого внутреннего фрагмента. Иногда в геле обнаруживаются дополнительные полосы, происхождение которых неизвестно. Однако они не мешают анализу специфических фрагментов методом РНКазного расщепления или ДГГЭ. При использовании метода nested oligo такие полосы не появляются. [c.144]

При практическом использовании ПЦР, по крайней мере, три характеристики этого метода наиболее важны для исследователя - это специфичность реакции, точность синтеза ДНК и его эффективность [263]. При абсолютной специфичности ПЦР продукт должен быть копией именно того локуса, который амп-лифицировали, а другие амплифицированные последовательности нуклеотидов в продукте ПЦР не должны присутствовать. При этом, как правило, не обращают внимания на то, имеются ли в продукте ПЦР ошибочно включенные нуклеотиды, которые некомплементарны амплифицируемому участку ДНК и появляющиеся благодаря сбоям в работе ДНК-полимеразы. Такой подход имеет место, например, при ДНК-диагностике инфекционных за- [c.194]

Изменение структуры хромосом. Амплификация генов часто (но не всегда) сопровождается существенными морфологическими изменениями хромосом. Эти изменения могут быть нескольких типов, и какой именно из них реализуется, зависит от вида клеток и самого гена. Иногда накапливаются очень маленькие дополнительные хромосомы, называемые двойными мини-хромосомами (рис. 10.88, ), которые, по-видимому, содержат амплифицированные последовательности. Двойные мини-хромосомы ацент-ричны и при делении клетки распределяются неравномерно. Этот факт, а также то, что клетки, содержащие много двойных мини-хромосом, растут хуже, чем нормальные клетки, означает, что в неселективной (не содержащей лекарственного вещества) среде резистентность клеток постепенно утрачивается. [c.309]

Морфологические изменения второго типа обнаруживаются в нормальных во всем остальном хромосомах и проявляются в атипичном характере исчерченности определенных областей при дифференциальном окрашивании (рис. 7.23) эти области называют гомогенно окрашивающимися (HSR). Как правило, они весьма протяженны, и хромосома, содержащая HSR, длиннее своего гомолога (рис. 10.88, ). В клетках, устойчивых к метотрексату, после гибридизации in situ с радиоактивным зондом, представляющим собой клонированный дигидрофолатредуктазный ген, и обработки фото-чувствительной эмульсией на HSR обнаруживаются зерна серебра. Таким образом, амплифицированные последовательности находятся внутри HSR. В хромосомах клеток сирийского хомячка, содержащих амплифицированные гены аспартат-карбамоил-трансферазы, также обнаруживаются лишние протяженные участки. Поскольку эти участки окрашиваются негомогенно, они не являются HSR, но тем не менее содержат амплифицированные сегменты ДНК (рис. 10.88, В). В некоторых случаях амплификация гена AD происходит и в нормальном локусе AD сирийского хомячка (в хромосоме В9р), хотя другие хромосомы тоже могут содержать много копий этого гена и иметь разнообразные аномалии (рис. 10.88, Г). Могут встречаться и двойные мини-хромосомы. Во всех исследованных случаях амплификация касается только одной пары гомологичных хромосом. В отличие от нестабильных амплифицированных генов в двойных мини-хромо- [c.309]

Амплифицированная последовательность в основном выявляется в виде множественных кольцевых внехромосомных мелких образований — DM-хромосом (от англ. double minute). DM-элементы не имеют центромеры, поэтому распределяются в митозе случайным образом, что обусловливает нестабильность признака устойчивости к использованному для амплификации соединению. [c.344]

Множественные копии амплифицированной последовательности локализованы в одной или реже в нескольких хромосомах. Амплифицированная область хромосомы может содержать до нескольких сотен последовательностей изучаемого гена. При этом наряду с прямыми повторами могут быть и инвертированные, а также иногда наблюдаются перестройки в амплифици-руемых последовательностях. Эффективность амплификации интегрированного в геном клетки гена и стабильность хромосом, содержащих амплифицированный ген, существенно зависят от места интеграции трансформирующего гена (эффект положения гена). Обнаружено, что в амплифицируемом сегменте ДНК находится участок инициации репликации (ori) хромосомной ДНК. Это позволяет из ДНК линий клеток с высокой степенью амплификации изучаемого сегмента достаточно просто выделять рестрикционный фрагмент, содержащий данный хромосомный ori, и клонировать его. [c.344]

Наблюдаемые различия в структурной организации и локализации амплифицированных последовательностей привели к предположе- [c.344]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология