Этап 4. Клонирование ДНК

Таким образом, последовательность этапов клонирования и экспрессии гена может протекать в следующей очередности [c.211]

Последовательные этапы клонирования опухолевых лимфоидных клеток представлены на стр. 408 в виде схемы. [c.409]

Этап 5. Клонирование гена. [c.217]

Этап поиска и клонирования генов (их выделение и сборка в одну конструкцию) уже отлажен. Гены, кодирующие белки, состоят, как правило, из трех основных участков промотора (определяющего экспрессию данного гена, с чего начинается транскрипция) кодирующей части (где содержится информация о структуре белка — продукта этого гена) и поли-А-области (цепочки адениновых нуклеотидов, ответственной за окончание транскрипции). В генной инженерии из частей разных генов получают рекомбинантные (химерные) гены. Например, кодирующий участок в таком гене может быть позаимствован у любого организма. Возможность свободно обращаться с генетическим материалом — основное преимущество молекулярной селекции перед традиционной, где перенос генов происходит лишь между близкородственными видами. Кроме того, используя подходящие промоторы, можно добиться, чтобы экспрессия гена происходила в нужных органах или тканях (корнях, клубнях, листьях, зернах) и в нужное время (скажем, при дневном освещении). [c.101]

Технология генетической инженерии состоит из следующих основных этапов получения трансгенных растений 1) выбор гена и его клонирование 2) подбор генотипа растения-реципиента 3) введение гена и его экспрессия в геноме растения-реципиента 4) регенерация трансформированных клеток и отбор трансгенных растений. [c.49]

Получение растений, устойчивых к гербицидам, методами генной инженерии прежде всего основывается на изучении молекулярных механизмов толерантности и включает следующие этапы выявление мишеней действия гербицидов в клетке растений, отбор растений/бактерий, устойчивых к данному гербициду (в качестве источника генов резистентности), идентификация и клонирование этих генов, изучение их экспрессии для использования в трансгенных конструкциях. [c.74]

Клонирование эмбрионов путем пересадки ядра включает три основных этапа выделение интактного ядра донора, энуклеацию ооцита, пересадку ядра в энуклеированную яйцеклетку. В отличие от амфибий пересадка ядра у млекопитающих не стимулирует ооцит. Поэтому требуется четвертый этап — активация ооцита и слияние мембран яйца и ооцита. 218 [c.218]

Все перечисленные этапы составляют сущность процесса клонирования, с помощью которого можно получить более миллиона копий любого фрагмента ДНК. Если клонированный фрагмент кодирует белок, то возможно экспериментально изучить молекулярный механизм регуляции транскрипции этого гена и наработать такой белок в нужном количестве. Внедрение подобных механизмов в многотоннажное производство с целью получения продуктов с набором полезных характеристик является одной из главных целей генной инженерии и биотехнологии вообще. Например, если ввести в генотип почвенных бактерий гены нитрифицирующих бактерий, то почвенные бактерии смогут переводить молекулярный азот воздуха в связанный азот почвы. [c.496]

Как обсуждалось в гл. 13, наследственная информация, заключенная в нуклеотидной последовательности ДНК, сохраняется неизменной благодаря действию сложных метаболических механизмов, обеспечивающих осуществление репликации и репарации. Мутации могут быть результатом ошибки на любом из многочисленных последовательных этапов этих процессов. Мутагенные факторы способны изменять как непосредственно структуру ДНК, так и структуру ферментов, прямо или косвенно участвующих в соответствующих метаболических процессах. Для понимания механизмов мутаций требуется знание нуклеотидной последовательности гена дикого типа и мутантного гена. Без этого невозможно понять связь между изменениями, происходящими в структуре ДНК и действием конкретных факторов или условий среды, вызывающих мутации. Современные методы клонирования генов сделали возможным прямое определение нуклеотидной последовательности ДНК. Однако еще совсем недавно при изучении молекулярной природы мутаций приходилось анализировать аминокислотные замены в белках, синтезируемых мутантными генами, а затем с помощью таблиц генетического кода выявлять изменения в нуклеотидной последовательности. [c.8]

Нередко возникает задача ввести ген в клетки эукариот, например в дрожжевые клетки, в которых могут нарабатываться белки, прошедшие после их образования необходимые стадии модификации, несвойственные прокариотическим клеткам. Для этой цели используют специальные, так называемые челночные, векторы, которые могут автономтю размножаться как в прокариотических, так и в эукариотических клетках, например в Е.соН и дрожжах. В эукариотические клетки плазмиды вводят на заключительных стадиях, поскапьку многие предварительные этапы клонирования существенно проще проводить в кле гках прокариот. [c.304]

Если на первом этапе клонирования использовался метод дробовика , то бактерии, включившие донорную ДНК, совсем не обязательно будут нести фрагмент ДНК с нужным геном. Донорная ДНК представляет собой смесь очень большого числа рестрикционных фрагментов (в случае ДНК человека — до миллиона). Даже в том случае, когда все эти фрагменты клонируются, нужный ген или участок ДНК будет содержать только один из них или несколько. Смесь клонов, полученных таким путем, называется библиотекой. Библиотеку можно также получить, если на первом этапе использовать обратную транскриптазу и смесь мРНК. Иногда это приходится делать, если нужную мРНК нельзя выделить в чистом виде. Таким образом, в тех случаях, когда клонировался не одиночный ген (синтезированный или считанный с мРНК одного типа), после четвертого этапа получают бактериальные культуры в виде библиотек. [c.224]

Коинтегративный вектор. Один из способов, облегчающий введение чужеродной ДНК в геном растения, заключается в использовании коинтегративных векторов. Смысл подхода состоит в следующем (рис. 2.3). Весь процесс введения чужеродного гена в геном растений делится на два этапа клонирование гена, который следует встроить в растительный геном, и собственно трансформация растительной клетки. Эти два этапа осуществляются с помощью различных векторов. [c.54]

Описанное выше в качестве одного из этапов клонирования разрезание генома на фрагменты с помощью рестрицирующей ххуклеазы называют иногда методом дробовика (шотган-клонирование). Фрагменты ДНК образуются при этом в огромном количестве - до миллиона, если речь идет о геноме млекопитающих, а это значит, что и число различных колоний трансфицированных клеток также должно достигать миллионов. Каждая такая колония представляет собой клон, т. е. совокупность потомков одной клетки-родоначальницы, и рекомбинантная плазмида в любой клетке клона несет одхху и ту же включенную в нее нуклеотидххую последовательность геномной ДНК. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а вся совокупность плазмид вмещает библиотеку геномной ДНК. Однако, поскольку разрезание геномной ДНК на фрагменты определяется случаем, лишь некоторые образовавшиеся фрагменты содержат полноценные гены во многие из них попадает только часть какого-нибудь гена, а в большинстве клонов геномной ДНК, полученных из ДНК высших эукариотических клеток. [c.328]

Рис. 8.2. Этапы клонирования кДНК методом двойных линкеров

Исходные гибридные клетки могут иметь неклональное происхождение, особенно если гибридные колонии растут в большинстве ячеек. Они могут представлять собой смесь клонов-продуцентов и непроду-центов, а также смесь разных клонов-продуцентов. Для получения моноклональных антител необходимо, чтобы производящие их клетки были потомками единичных клеток. Достигается это последовательными этапами клонирования, которое осуществляется 2—3, а иногда и более раз. [c.200]

При таком подходе при втором клонировании число позитивных ДОНОВ оказывается близким к 100 %. Если нет, то процедура и актика повторяются. На всех этапах клонирования гибридные летки параллельно размножаются в небольших количествах а пластинах с 24 ячейками и криоконсервируются. [c.201]

Описан метод, позволяющий in vitro получать количественные и качественные характеристики стволовых стромальных клеток кроветворных и лимфоидных органов (КОКф). КОКф обеспечивают создание гемопоэтнческого и иммунологического микроокружения, а КОКф костного мозга служат стволовыми остеогенными клетками. Подробно разбираются этапы клонирования КОКф и пассирования нх потомков в культурах. Приведены способы определения по результатам клонирования, т. е. по количеству колоний фибробластов, истинной концентрации КОКф в клеточных суспензиях и исходных гемопоэтических органах обсуждаются значение и перспективы применения культурального теста на КОКф. Библиогр. 16 назв. [c.318]

Придавая серьезное значение достоверности имеющихся сведений, штат этой базы данных в качестве одной из своих целей ставит перед собой идентификацию и удаление нуклеотидных последовательностей, принадлежащих векторам и занесенных в банк данных по недосмотру авторов. Так, в результате обследования почти 1 млн последовательностей было обнаружено, что 0,36% из них загрязнены векторными последовательностями (представляющими собой обычно область полилинкера), причем подавляющее большинство таких участков располагалось или на 5 -, или на З -конце заносимых в базы данных фрагментов ДНК и лишь немногие несли векторные участки на обоих концах. Еще меньшее число несло подобные участки внутри секвенированного фрагмента ДНК, являющиеся результатом или каких-то перестроек, или образования химерных конструкций на этапе клонирования. После обнаружения такого векторного загрязнения де- [c.352]

Векторные молекулы играют важнейшую роль на этапе клонирования ш vivo изучаемых последовательностей ДНК. Конкретные векторы будут рассмотрены в дальнейшем для каждой генно-инженерной системы отдельно. Использование клонирующих векторов позволяет получать необходимый фрагмент ДНК в индивидуальном состоянии и в препаративных количествах. Это подняло на качественно новый уровень исследования структурно-функциональной организации геномов как прокариотических, так и эукариотических организмов (см. 1.7). Разработка и совершенствование экспрессирующих векторов позволяет все с большей определенностью создавать штаммы — суперпродуценты чужеродных белков. [c.32]

В то же время небольшая фракция мутантных последовательностей не влияет на результат таких аналитических процедур, как прямое секвенирование и гибридизация на фильтрах со специфичными олигонуклеотидными пробами. Ошибки, возникшие на этапе клонирования и секвенирования индивидуальных амплифи-цированных in vitro фрагментов, легко выявляются анализом нескольких независимых клонов гибридных ДНК и установлением исходной, наиболее часто встречающейся последовательности нуклеотидов. Если ошибка была введена на начальной стадии амплификации сегмента ДНК, то мутантная форма может составлять большую долю полученного препарата. В этом случае для достижения достоверного результата и выявления гибридной ДНК, содержащей природн)то последовательность, необходимо осуществлять либо прямое секвенирование независимо амплифицированных проб ДНК, либо анализ ряда клонов гибридных молекул ДНК, полученных после независимых ПЦР. [c.50]

Высокая консервативность гомеоблока проявляется не только при исследовании разных генов развития у дрозофилы. Перекрестная гибридизация с гено.мами червей, иглокожих и позвоночных, включая человека, выявила наличие нескольких фрагментов геномной ДНК, гибридизующихся с гомеоблоком дрозофилы. Если гены этих организмов, содержащие подобные последовательности, также вовлечены в регуляцию ключевых этапов развития, то гомеоблок дрозофилы может рассматриваться как способ их выявления и клонирования. Регуляторные механиз.мы, контролирующие развитие, могут оказаться более универсальными, чем ожидалось. [c.218]

Миллер, Лу и их сотрудники [145а, Ь] с успехом использовали супрессорные мутации и получили с их помощью около 300 мутантных типов Za -репрессорного белка Е. соИ. На первом этапе вводили атЬег-мутации приблизительно в 80 положений гена. Далее с целью клонирования мутантные гены переносили в эписомы (см. следующий раздел). Затем эти вирусоподобные эписомы использовали для заражения пяти штаммов бактерий, несущих супрессорные мутации, благодаря которым считывание кодона UAG (терминирующего) приводило к включению в белок различных аминокислот. Из этих инфицированных бактерий выделяли большие количества мутантных форм 1ас-репрессора. Оказалось, что многие мутации, локализованные вблизи от N-конца, влияют на связывание репрессора с ДНК, тогда как мутации, локализованные в центральной части, влияют на связывание с индуктором. [c.256]

Генно-инженерные методы более перспективны для создания улучшенных сортов, так как позволяют избирательно вводить в геном растения-реципиента гены искомого признака. Операции по получению трансгенных растений с улучшенным аминокислотным составом белка разделены на ряд этапов 1) клонирование генов запасных белков 2) изучение механизмов тканеспецифичной и временной экспрессии белков и вьювление последовательностей [c.149]

Типичный эксперимент по клонированию генов включает следующие этапы. 1. Рестрик-тазное расщепление ДНК, выделенной из организма, который содержит искомый ген. 2. Обработка вектора для клонирования (обычно плазмидного), который может реплицироваться в клетке-хозяине, теми же рестриктазами, которые использовались для расщепления донорной ДНК. 3. Смещивание этих двух образцов ДНК и сшивание фрагментов ДНК-лигазой фага Т4. 4. Трансформация сшитыми молекулами клеток-хозяев. Амплификация рекомбинантной ДНК в трансформированных клетках. [c.78]

К сожалению, обычно бывает неизвестно, какую нуклеотиднуто замену в клонированном гене нужно произвести, чтобы получить белок с нужными свойствами. Поэтому часто приходится изменять один определенный нуклеотидный сайт всеми возможными способами. Например, можно синтезировать олигонуклеотидные праймеры, в одном из сайтов которых находятся разные нуклеотиды. Такие вырожденные олигонуклеотиды обычно получают, добавляя в автоматический синтезатор ДНК на определенном этапе, когда к цепи должен просоеди-няться специфический нуклеотид, небольшое количество (до нескольких процентов) трех других нуклеотидов (рис. 8.5). В результате получается гетерогенный по одному сайту набор олигонуклеотидных праймеров, с помощью которых можно получить соответствующий набор мутантных генов-мишеней с нуклеотидными заменами в специфическом сайте. [c.163]

Амплифицированные кДНК обрабатывают специфическими рестрицирующими эндонуклеазами, а затем встраивают в вектор на основе бактериофага Х. кДНК Н- и L-цепей содержат разные, характерные для каждой из них эндонуклеазные сайты, что облегчает специфическое встраивание каждой нуклеотидной последовательности в свой вектор. На этом этапе происходит клонирование множества разных сегментов Н- и L-цепей (рис. 10.13, Ап Б). [c.218]

Праймер-опосредованная прогулка ( блуждающая затравка ) (Primer walking) Один из методов секвенирования протяженных сегментов ДНК (>1 т.п.н.) с использованием праймера (затравки), комплементарного концу уже известной последовательности. На основании данных, полученных на первом этапе, синтезируют новый праймер, перекрывающийся с концом уже секвенированного участка, и используют его для определения нуклеотидной последовательности следующего участка клонированной ДНК. Эту процедуру повторяют до тех пор, пока не секвенируют весь сегмент. [c.545]

Бластоцисты стали родоначальницами плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток типов ES и ЕК. Показано, что, например, ES-клетки доступны культивированию in vitro и после каких-либо манипуляций (например, после введения клонированных генов путем инфекции или трансфекции) можно инъецировать их в бластоцисту и BepHjrrb в живой макроорганизм. ES-клетки колонизируют эмбрион и составляют с ним единое целое, хотя колонизация ими зародышевого пути по разным причинам удается не всегда. Последующие этапы работы с трансгенными животными во многом сходны с. ранее описанными. Таким образом, все три метода получения трансгенных животных можно представить в виде следующей схемы по Д. Мерфи и Дж. Хенсону 1987 г. (см. рис. 166). [c.585]

Под действием электрического импульса происходит активация ооцита и слияние мембран между ядром клетки донора и энуклеированным ооци-том-реципиентом. Технология пересадки ядер клетки способствовала успешному получению клонированных живых кроликов, мышей, овец, коз, крупного рогатого скота и свиней. Было показано, что только эмбрионы на предимплантационной стадии являются тотипотентными, но эффективность этой технологии пока низка. У крупного рогатого скота была продемонстрирована следующая эффективность этой технологии на каждом этапе (%) энуклеация — 70—80, развитие морулы-бластоцисты клонированных эмбрионов — 20—30. В исследованиях K.P. Вондиоли (1991) 190 эмбрионов с пересаженными ядрами были получены из одного эмбриона путем многократной пересадки ядер из последовательно клонированных эмбрионов. Однако последовательные пересадки ядер после четвертого цикла сопровождались высокими эмбриональными потерями в матке. В итоге не удалось получить телят от пересадки эмбрионов, полученных после третьего цикла клонирования. [c.219]

Важным этапом работы по генетической трансформации растений является выделение и клонирование генов, создание на их основе векторов для переноса чужеродных генов из клеток-доноров в клетки-раципиенты. Использование плазмидных, транспозонных, вирусных, пневмобалли-стических и других векторных систем позволяет исследователям осуществлять трансформацию растительных генотипов и получать трансгенные (модифицированные) растения с заданными или близкими к ним свойствами и качественными характеристиками. [c.422]

Экспериментальные данные о процессах перегруппировки генов, кодирующих константные и вариабельные участки иммуноглобулиновых цепей, были получены с помощью методов, основанных на применении рекомбинантных ДНК. Для этого из фракции полисом выделяли мРНК, кодирующую L-цепь миеломы, на ее основе с помощью обратной транскриптазы получали кДНК, которую клонировали на плазмид-ном векторе. Наработанную в значительных количествах клонированную кДНК расщепляли подходящей рестриктазой таким образом, чтобы получить два фрагмента, соответствующих V- и С-участкам L-цепи. Фрагменты ДНК разделяли препаративно с помощью электрофореза, вводили радиоактивную метку с помощью ник-трансляции, денатурировали и использовали в качестве зондов для идентификации фрагментов рестрикции ДНК из миеломных или эмбриональных клеток, содержащих последовательности, комплементарные последовательностям зондов. Наиболее существенно, что, как показано на рис. 16.22, в ДНК клеток миеломы оба V- и С-кодирующих участка локализуются на одном и том же со RI-фрагменте, в то время как в эмбриональной ДНК они находятся на различных Есо RI-фрагментах. Это означает, что на каком-то этапе развития между эмбриональной клеткой и дифференцированным лимфоцитом происходит специфическая перестройка ДНК, которая в данном случае привела к удалению Есо RI-сайта (или сайтов), находившегося в рамках протяженной области ДНК между V- и С-ко-дирующим участками в эмбриональной ДНК. После такой перестройки эти участки оказались расположенными в непосредственной близости друг к другу. Комбинация генов L-цепи, возникшая при их перегруппировке в ходе дифференциации лимфоцита, при его последующем митотическом делении устойчиво наследуется дочерними клетками. [c.241]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология