Дробовика метод

Главная проблема в таком подходе — отобрать нужный штамм, несущий плазмиду с попавшим в нее искомым геном. Если существует критерий такого отбора, то этим методом можно получить хороший результат. И все же, хотя этим методом и был получен ряд ценных штаммов, вырабатывающих тот или иной бактериальный белок, за ним недаром закрепилось название метод дробовика . Он действительно напоминает стрельбу из дробовика, причем с закрытыми глазами. В этом раннем методе генной инженерии еще слишком большая роль отводилась случаю — случайная фрагментация, случайное встраивание. Все по- [c.62]

Метод дробовика - использование рестрикционных ферментов [c.219]

Этот неспецифичный метод выделения генов называют методом дробовика. Наиболее трудная задача при его использовании — найти фрагмент, который несет нужный ген эта проблема обсуждается в разд. 25.1.3. [c.220]

Использование обратной транскриптазы или химический синтез гена имеют преимущество над методом дробовика, поскольку получаемый при этом ген не является прерывистым . Прерывистые гены содержат один или несколько участ- [c.220]

Часто в ней используют донорную ДНК, полученную методом дробовика . [c.223]

Если для вьщеления донорной ДНК (например, методом дробовика ) использовали рестриктазу, той же самой рестриктазой должна быть обработана плазмидная ДНК. Рестрикционные фрагменты донорной ДНК, среди которых есть и фрагмент с нужным геном, смешивают затем с плазмидной ДНК. При смешивании они соединяются липкими концами. Например, липкий конец —ААТТ будет соединяться с комплементарным липким концом —ТТАА. Вначале соединение происходит за счет водородных связей, но после добавления фермента, называемого ДНК-лигазой, образуются фосфодиэфирные связи. [c.222]

Если в качестве донорной ДНК используется кДНК или синтетический ген (см. выше два первых метода вьщеления генов), то для встраивания ДНК в вектор следует действовать по схеме, представленной на рис. 25.6. Таже процедура необходима, если при использовании метода дробовика применялся фермент, образующий тупые концы. [c.222]

Если на первом этапе клонирования использовался метод дробовика , то бактерии, включившие донорную ДНК, совсем не обязательно будут нести фрагмент ДНК с нужным геном. Донорная ДНК представляет собой смесь очень большого числа рестрикционных фрагментов (в случае ДНК человека — до миллиона). Даже в том случае, когда все эти фрагменты клонируются, нужный ген или участок ДНК будет содержать только один из них или несколько. Смесь клонов, полученных таким путем, называется библиотекой. Библиотеку можно также получить, если на первом этапе использовать обратную транскриптазу и смесь мРНК. Иногда это приходится делать, если нужную мРНК нельзя выделить в чистом виде. Таким образом, в тех случаях, когда клонировался не одиночный ген (синтезированный или считанный с мРНК одного типа), после четвертого этапа получают бактериальные культуры в виде библиотек. [c.224]

Клонирование всего генома (в противоположность клонированию специфических фрагментов) часто называют шотган -экспериментами (shotgun experiment-метод дробовика). Для их осуществления весь геном разделяют на фрагменты удобного размера. Затем фрагменты встраивают в клонирующий вектор с образованием популяции химерных векторов. Набор таких клонированных фрагментов называют библиотекой генома. Библиотека, однажды полученная с помощью фагового или плазмидного вектора (чаще-фагового вектора, поскольку в таком виде легче хранить необходимые большие количества химерных ДНК), может храниться неограниченно долгое время и при появлении нового зонда быстро может быть использована для поиска специфического фрагмента. [c.243]

Описанное выше в качестве одного из этапов клонирования разрезание генома на фрагменты с помощью рестрицирующей ххуклеазы называют иногда методом дробовика (шотган-клонирование). Фрагменты ДНК образуются при этом в огромном количестве - до миллиона, если речь идет о геноме млекопитающих, а это значит, что и число различных колоний трансфицированных клеток также должно достигать миллионов. Каждая такая колония представляет собой клон, т. е. совокупность потомков одной клетки-родоначальницы, и рекомбинантная плазмида в любой клетке клона несет одхху и ту же включенную в нее нуклеотидххую последовательность геномной ДНК. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а вся совокупность плазмид вмещает библиотеку геномной ДНК. Однако, поскольку разрезание геномной ДНК на фрагменты определяется случаем, лишь некоторые образовавшиеся фрагменты содержат полноценные гены во многие из них попадает только часть какого-нибудь гена, а в большинстве клонов геномной ДНК, полученных из ДНК высших эукариотических клеток. [c.328]

Такая связь достигается в упорядоченных клонотеках в которых клоны, располагающиеся по соседству, содержат перекрывающиеся последовательности, а весь их ряд представляет непрерывную последовательность генома [233, 234]. Естественно, упорядочивание таких клонов возможно только после секвенирования клонированных последовательностей ДНК или определения особенностей их первичной структуры другими способами. Упорядоченные клонотеки содержат гораздо меньшее число клонов по сравнению с неупорядоченными, поскольку в последних каждый клон многократно дублирован. С такими клонотека-ми проще работать, но их значительно труднее создавать. Упорядоченные клонотеки ВАС-клонов ДНК человека были использованы международным консорциумом при выполнении программы Теном человека . В отличие от этого, американская фирма Selera при решении той же задачи пошла по другому пути, используя случайные клонотеки и метод дробовика (shot-gun), в котором осуществляли тотальное секвенирование потенциально перекрывающихся случайно выбираемых из клонотеки клонов, которые объединяли в непрерывную последовательность с помощью вычислительной техники. [c.161]

Система для секвенирования ДНК методом дробовика , основанная на разработанном одноцепочечном векторе, несущем удобный полилинкер, вызвала к жизни способ получения небольших фрагментов ДНК для их последующего клонирования с помощью частощепящих рестрикционных эндонуклеаз с тетрануклеотидными сайтами узнавания (рис. 8.4) [Messing et al., 1981]. Преимуществом этого способа можно считать относительную легкость этапа лигирования при условии использования рестрикционных эндонуклеаз, образующих фрагменты ДНК с липкими концами. Что касается лигирования рестрикционных фрагментов ДНК, несущих тупые концы, то и в этом случае не требовались дополнительные этапы, предшествующие лигированию, в отличие от других методов получения коротких фрагментов ДНК, рассматриваемых ниже. Главный недостаток данного подхода заключается в том, что сайты используемых рестрикционных эндонуклеаз могут быть расположены не очень равномерно и, таким образом, существует вероятность получить какой-нибудь субклон, несущий вставку довольно крупного размера, не позволяющую осуществить ее прочтение за один эксперимент. [c.241]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология