Рестрикционные ферменты

Метод дробовика - использование рестрикционных ферментов [c.219]

I — первый рестрикционный фермент из Е.соИ [c.220]

Наряду с рестрикционной активностью (или активностями) бактериальный штамм обладает способностью метилировать ДНК для этого процесса характерна такая же специфичность в отношении последовательностей ДНК, как и для рестрикции. Метилаза добавляет метильные группы к адениновым или цитозиновым остаткам в том же сайте, в котором связывается рестрикционный фермент. В результате метилирования сайт становится устойчивым к рестрикции. Следовательно, метилирование защищает ДНК от разрезания. [c.432]

Рестрикционные ферменты относятся к двум основным классам, которые в свою очередь могут быть подразделены на более мелкие группы. Их свойства суммированы в табл. 34.1. [c.432]

Первый класс включает ферментативные активности типа II. Сюда относят рестрикционные ферменты, уже обсуждавшиеся ранее. Они обнаруживаются примерно [c.432]

Большинство рестрикционных ферментов типа II разрезают ДНК в неметилированном сайте-мишени. В каждой цепи ДНК разрезается одна связь разрезание может производиться последовательно. Некоторые ферменты вносят ступенчатые разрезы, другие вызывают образова- [c.433]

Если плазмиду не удается гидролизовать рестрикционными ферментами, ее можно дополнительно очистить с помощью экстракции смесью фенол/ хлороформ между стадиями 19 и 20 следующим образом. [c.48]

Использование рестрикционных ферментов для расщепления ДНК и анализ полученных фрагментов с помощью электрофон реза в агарозном геле подробно обсуждаются в разд. 5.2 и 1з, поэтому в данном разделе мы на этих вопросах останавливаться не будем. [c.71]

Представляющий интерес ген может быть введен в плазмиду так, чтобы он находился вблизи сильного промотора (для данного организма-хозяина). Промотор представляет собой сайт ДНК, ответственный за трансляцию белка на матричной РНК в рибосоме. Поэтому использование так называемого экспрессированного вектора данного типа делает транскрипцию и трансляцию более эффективными, тем самым приводя к увеличению производства белка. Сконструирован ряд плазмид, которые содержат сайты рестрикционных ферментов, что позволяет вставлять чужеродную ДНК в непосредственной близости от эффективного промотора. [c.96]

Наружная мембрана плотно прилегает к муреиновому слою и связана с ним липопротеинами. Муреиновый слой, видимо, свободно проницаем для различных веществ. Промежуток между муреином и плазматической мембраной называют периплазматическим пространством. В нем находятся белки, в том числе деполимеразы (протеиназы, ну-клеазы, например рестрикционный фермент E oRI), периферические белки плазматической мембраны и так называемые связующие белки. Последние участвуют в переносе некоторых субстратов в цитоплазму и служат рецепторами хемотаксических стимулов. Периплазматическое пространство, по всей вероятности, играет также роль в осморегуляции. [c.60]

Очевидно, что бактериальная клетка должна как-то защищать свою ДНК от воздействия собственной рестрикционной эндонуклеазы. Такую защиту обеспечивает метилирование или глюкозилирование определенных оснований ДНК, обычно аденина или цитозина. Этот процесс известен под названием модификации. Из него извлекают пользу также и фаги, размножающиеся в клетках определенного штамма бактерий. На фаговую ДНК при ее синтезе в клетках данного типа накладывается тот же отпечаток , что и на ДНК самой клетки в присутствии модифицирующего фермента фаговая ДНК видоизменяется таким же образом, как и ДНК хозяина. Она так же метилируется и приобретает свойства, запщщающие ее от воздействия рестрикционных ферментов данного штамма бактерий. [c.468]

Природу восьмеркй" ожно определить, если подействовать на нее рестрикционным ферментом, разрезающим каждое мономерное кольцо только в одном сайте. Если две части молекулы, имеющей вид восьмерки, не связаны ковалентно, они разделятся. Если же восьмерка -результат рекомбинации, ее разрезание приведет к появлению структуры, в которой родительские молекулы удерживаются вместе областью гетеродуплексной ДНК в точке слияния. Разрезанная молекула имеет четыре ответвления, причем каждая пара ответвлений соответствует каждому из исходных мономерных колец. В разрезанной форме молекула получила название hi-структуры, поскольку она напоминает греческую букву х Её" м15крофотография представлена на рис. 35.6 вместе с поясняющей схемой. Четыре ответвления двухцепочечных ДНК соединены областью, в которой гетеродуплексные сегменты были разорваны на составляющие их отдельные цепи (по-видимому, в результате приготовления препарата для электронной микроскопии). Такая структура точно соответствует предсказанной (рис. 35.2 и 35.4) ее выделение является прямым доказательством существования гетеродуплексной ДНК in vivo. [c.448]

Многие рестрицирующие иуклеазы вносят разрывы в две цепи ДНК со смещением на несколько нуклеотидов, так что на концах фрагментов образуются короткие одноцепочечные участки. Эти одноцепочечные концевые участки обладают способностью образовывать комплементарные пары оснований с любым другим одноцепочечным участком, полученным с помощью того же фермента, и потому их называют липкими концами (рис. 4-63). Липкие концы, образованные рестрикционными ферментами, позволяют легко соединить два любых фрагмента ДНК воедино при условии, что эти фрагменты образовались после действия одной и той же рестрицирующей нуклеазы (рестриктазы) (либо иной нуклеазы, которая создает такие же липкие концы). Таким образом, фрагмент ДНК любого происхождения можно встроить в очищенную ДНК автореплицирующегося генетического элемента, которым, как правило, является плазмида или бактериальный вирус. Бактериальный клон, содержащий такую плазмиду или вирус, можно сравнить с фабрикой по производству этого фрагмента ДНК. Исходный фрагмент может происходить прямо из геномной ДНК, или из к ДНК (комплементарной ДНК), т. е. из ДНК, полученной копированием матричной РНК. Эти методы детально обсуждаются в гл. 5. [c.231]

В прошлом генетика человека и медицинская генетика развивались как относительно независимые отрасли науки, теперь многие их разделы оказались вовлеченными в общее русло молекулярно-генетичес-ких исследований, и провести между ними грань-трудно. В рамках учебника невозможно описать в деталях все молекулярно-биологические методы, которые привели к столь внушительному прогрессу генетики человека, поэтому следует обратиться к более специальным источникам [366 493 60]. Однако принципы новых подходов должны быть понятны всем исследователям, даже тем, кто изучает эволюцию или генетику поведения. В следующем разделе в качестве примера описывается анализ (3-глобинового генного кластера человека (разд. 4.3). Кроме методов, основанных на использовании рестрикционных ферментов, обсуждаются также методы гибридизации нуклеиновых кислот, сек-венирования ДНК и сортировки хромосом при помощи цитофлуорометрии. [c.122]

Полиморфизм ДНК. Для экспрессируемых продуктов генов, таких, как группы крови, белки тканей и крови, характерен высокий уровень полиморфизма, однако генетическая изменчивость, наблюдаемая на уровне ДНК, существенно выще. Поскольку значительная часть генома, вероятно, не принимает прямого участия в регуляции или кодировании продуктов генов, мутации в этих нерегуляторных и некодирующих участках ДНК не имеют фенотипического выражения и являются селективно нейтральными. Определение последовательностей нуклеотидов у различных индивидов и использование рестрикционных ферментов для картирования генома человека выявило необыкновенно высокую изменчивость на [c.288]

Все рассмотренные количественные методы определения активности рестрикционных ферментов выполняются путем отбора проб в ходе реакции и их анализа. Халфордом и Джонсоном [114] был предложен и реализован на примере КЕсоК I непрерывный способ регистрации кинетики реакции. Он основан на разной способности связывать этидиум бромид сверх-скрученной и пикированной формами кольцевых молекул ДНК. Это приводит к изменению флуоресценции, что и регистрируется при помощи флуориметра. [c.129]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология