Космиды рекомбинация

Отбор космид с помощью гомологичной рекомбинации [c.77]

Рис. 3.2. Принципиальная схема рекомбинации между космидой и п,

Необходимо рассмотреть и ряд других потенциальных трудностей. Одна из них заключается в том, что на космидные клоны неизбежно воздействует рекомбинационная система клетки-хозяина, что может привести к перестройкам в космидных последовательностях. В наших опытах такие перестройки были достаточно редкими, возможно, из-за короткого времени пребывания космид в гес+-условиях, а также благодаря отбору полноразмерных клонов, что предопределяется самой системой селекции. Стабильность космид в процессах рекомбинации и реверсии к исходной структуре была испытана, в частности, во многих последовательных циклах рекомбинации — реверсии, и никаких свидетельств перестроек обнаружено не было [5]. [c.83]

Клонирование с помощью рекомбинации позволяет с наи-меньщими усилиями скринировать большое множество космид. В основе метода лежит тот факт, что фаг К в общем случае не является трансдуцирующим фагом, т. е. упаковывается только ДНК, расположенная между двумя os-последовательностями, разделенными достаточным расстоянием. [c.62]

Индукция профага приводит к упаковке космиды Кт , но не плазмиды Ар Однако если между фрагментами ДНК, клонированными в космиде и в плазмиде, имеется гомология, то между гомологичными последовательностями может с частотой 10 произойти рекомбинация, в результате которой оба вектора объединяются в одну крупную кольцевую космиду. Только в этом случае упаковка обеспечит возможность трансдукции обоих маркеров Д /п и Лр . Поэтому для клонирования какого-либо гена достаточно лишь вставить небольшой фрагмент его ДНК в плазмиду-зонд, содержащуюся в линии хелперных клеток, суперинфицировать их космидной библиотекой (упакованной, как указано в разд. 2.2.8.5), индуцировать профаг в хелперных клетках и высеять их на чашки с Km и Ар. Колонии с двойной лекарственной устойчивостью должны в принципе содержать ген, клонированный в космиде, в которую интегрировала плаз-мида-зонд. [c.62]

Настоящая глава посвящена генетическим подходам к выделению, генноинженерному манипулированию и анализу индивидуальных космидных клонов или библиотек клонов. В ней представлены методики упаковки космидных клонов в лямбо-доидные фаговые частицы и отбора нужных космид (или плазмид) из полных библиотек путем гомологичной рекомбинации. Рассмотрены также способы модификации отобранных клонов или групп клонов с помощью вставок или замещений определенных последовательностей. [c.74]

КОСМИДНЫМИ клонами. Это особенно существенно для описанных ниже методов рекомбинации космид. В этом случае упаковка in yvo обеспечивает две независимые важные функции — перенос осмид между различными штаммами-хозяевами и селекцию космидных клонов, рекомбинировавщих с плазмидой-зопдом. [c.77]

Главное условие для проведения экспериментов по космид-но-плазмидной рекомбинации — это отсутствие гомологии в последовательностях обоих векторов, так как это исключит возможность их гомологичной рекомбинации между иими. Кроме того, необходимо ввести космидную библиотеку, исходно сконструированную и амплифицированную в г< сЛ"-клетке, в полноценный по рекомбинации штамм, несущий селективную плазмиду (плазмиды). Наконец, необходимо обеспечить возможность селекции рекомбинантных космид после их повторного переноса в гесЛ -хозяина с тем, чтобы убедиться в стабильности клонов при их дальнейшем размножении. [c.78]

Принцип метода схематически показан на рис. 3.2. Космидные библиотеки, сконструированные в гесЛ -клетке, упаковывают в Я-частицы, чтобы получить лизат с высоким титром трансдуцирующих частиц. Аликвоты упакованной библиотеки используют затем для заражения гес+-клеток, в которые предварительно введена последовательность (или последовательности) -зонд, клонированная в плазмиде, не имеющей гомологии с космидным вектором. Через 30 мин — 2 ч, в течение которых должна произойти рекомбинация, космиды вновь упаковывают в фаговые частицы. Упакованные космиды используют для заражения гесЛ -хозяина, проводя селекцию по обоим маркерам лекарственной устойчивости — плазмидному и космидному. Поскольку плазмида не несет os-последовательностей, она будет перенесена в реципиентные клетки только в случае рекомбинации с гомологичной последовательностью в космидном клоне. Для того чтобы восстановить исходную космиду, можно вновь разделить два клопа в результате второго рекомбинационного события и после переноса в нового хозяина идентифицировать ревертантов на индикаторных чашках. Как будет сказано ниже, точное восстановление, однако, не всегда возможно (или желательно). [c.78]

Основное достоинство генетического подхода — быстрота и эффективность метода достаточно большое число экспериментов можно проводить параллельно. Поэтому не возникает нужды в повторном скрининге, что делает этот метод особенно удобным там, где требуется повторное выделение многих космид (например, при прогулке по хромосоме ). Другое преимущество генетического метода — очень высокая чувствительность гомологичной рекомбинации к ошибочному спариванию последовательностей [25, 26], Данное обстоятельство может быть особенно удобным, например, при выделении космид, содержащих конкретные копии тех или иных семейств генов, или в экспериментах по прогулке по хромосоме . Такие эксперименты упрощаются при работе с некоторыми из наших новых векторов (Эрих и др., в печати), содержащих ЫоИ-сашы, фланкирующие инсерционный сайт, что позволяет провести быстрое и избирательное клонирование концевых фрагментов вставки в производных риС18 или рЕМВЬ18, содержащих 7Уо/1-сайты в полилинкере. [c.84]

Известно два основных нути желаемая структура может быть образована в один этап, нанример, в результате рекомбинации в пределах короткого района гомологии — при введении последовательностей, содержащихся в селекционной плазмиде, в специфический участок космидного клона (рис. 3.3). Примером может служить подстановка энхансерных или промоторных последовательностей в участок, предшествующий гену, введение селективных маркеров или индикаторных генов (устойчивости к неомицину, хлорамфеникол-ацетилтрансферазы, р-га-лактозидазы) под контроль промотора, который несет космида, или создание случайных составных сегментов, образованных гомологичными генами, принадлежащими космиде и плазмиде. При необходимости может быть использован перенос в клетки-хозяева, непермиссивные для репликации одного из этих компонентов, что позволяет элиминировать независимо реплицирующиеся плазмиды, возникающие в результате вторичных рекомбинационных событий. Сходным образом селекционные плазмиды с последовательностями, гомологичными космидному вектору, используют для введения специфических последовательностей (например, маркеров, селектируемых в эукариоти- [c.85]

Может также быть использован и альтернативный двухступенчатый процесс, приводящий к обмену последовательностями между плазмидой и космидой. При использовании подходящей системы селекции или переноса космида или плазмида может быть получена раздельно. Поэтапно, например, можно ввести мутации, индуцированные в коротком районе гена, клонированного в упаковывающейся плазмиде, обратно в космиду. Наоборот, можно перенести последовательности из космиды в плазмиду для дальнейшего анализа. Как показано на рис. 3.4, такой процесс особенно хорошо контролируется в двухэтапном варианте метода, когда исходная маркерная последовательность (например, /ас-оператор) вводится в результате двойной рекомбинации в тот локус космиды, который должен быть мутагенизирован. Обмен этой последовательности на последовательности, несущие желательную мутацию, легко обнаружить с помощью теста на присутствие или отсутствие /ас-оператора (см. методику получения реверсий). [c.86]

Модификация космидных клонов путем гомологичной рекомбинации — исключительно эффективный и высокоизбирательный процесс. В большинстве случаев, когда работают с интакт-ными космидами, подходящие сайты рестрикции либо трудно идентифицировать, либо их вовсе нет. И преимущество генетических подходов обычно состоит в том, что они требуют значительно меньших затрат труда. [c.86]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология