Космиды упаковка

Таблица 2.6. Упаковка космид путем суперинфекции жидкой культуры

Рис. 2.1. Конструирование рекомбинантов по методу Иш-Горовица и Берка [10]. с — сайт клонирования, х и у — другие уникальные рестрикционные сайты. Космиды расщепляют один препарат по сайту х, другой по сайту у и обрабатывают фосфатазой. Затем каждый препарат разрезают по сайту с. Нужные плечи — те, которые несут со5-сайты в правильной (показано маленькой стрелкой) ориентации. Желательно, хстя и необязательно, индивидуально выделять необходимые фрагменты до лигирования. Методика построена так, чтобы исключить образование мультимеров космид, которые могли бы эффективно вовлекаться в упаковку.

Любая ДНК, находящаяся между двумя со5-сайтами, может быть упакована в оболочку фага. На этом основан метод клонирования с использованием космид , описанный в гл. 19. Важно, однако, чтобы расстояние между двумя со5-сайтами не сильно отличалось от естественной длины фага лямбда. Если это расстояние будет слишком большим или слишком малым, то ДНК не будет упакована в оболочку. Этот факт свидетельствует о том, что для завершения процесса упаковки количество ДНК должно быть достаточным и что в головке фага может поместиться совсем немного избыточной ДНК (примерно 15%). [c.346]

S.4. Упаковка индивидуальных космид с использованием суперинфекции [c.57]

Таблица 2.7. Упаковка космид путем суперинфекции культур на чашках

Для отбора уникальных клонов из сложной библиотеки (например, генов млекопитающих) применяется методика, изложенная в табл. 3.4. Космиды могут быть получены упаковкой библиотеки с использованием суперинфекции (табл. 3.2) или путем индукции лизогена (табл. 3.3). [c.90]

Смеси для упаковки космид [c.35]

Ценность таких векторов возросла с появлением систем упаковки ДНК в фаговую частицу in vitro. Попытка объединить некоторые преимущества плазмид и фагов привела к созданию космид. Это плазмиды со встроенными специфическими последовательностями ДНК (со5-сай-тами), отвечающими за упаковку ДНК фага X в фаговой частице. Такие векторы по-прежнему могут существовать в бактериях в виде плазмид, но могут быть выделены и в чистом виде путем их упаковки в фаговые частицы in vitro. На длину этих векторов также накладывается ограничение, обусловленное размером головки фага, но такой геном не должен включать гены, необходимые для литического цикла. [c.238]

Обычно на чашку диаметром 14 см можно высеять 400— 500 мкл суспензии клеток, полученных, как описано в разд. 2.2.5.3. В стандартном опыте (50 000 космид из реакции упаковки) хорошим выходом можно считать около 17 000 колоний на чашку. Применяйте чашки с толстым слоем L-arapa (100 мл на чашку), в который добавлен соответствующий антибиотик. Если возможно, используйте чашки, разлитые один-два дня назад, тогда они не будут слишком влажными. После высева, если нужно, подсушите чашки в стерильном боксе и инкубируйте, перевернув вниз крышкой, в течение 24 ч. [c.52]

Космидная ДНК может быть упакована in vitro подобно ДНК фага X. Однако эффективность упаковки космид существенно ниже, так как препарат содержит в основном мономерные кольца с одним os-сайтом, которые не могут служить субстратом в упаковочной реакции. Эффективность упаковки, как правило, колеблется между 10 и 10 в расчете на 1 мкг ДНК. Однако есть смысл прибегнуть к этому методу, если не удалось использовать бактериальный и фосмидный подходы. [c.59]

Индукция профага приводит к упаковке космиды Кт , но не плазмиды Ар Однако если между фрагментами ДНК, клонированными в космиде и в плазмиде, имеется гомология, то между гомологичными последовательностями может с частотой 10 произойти рекомбинация, в результате которой оба вектора объединяются в одну крупную кольцевую космиду. Только в этом случае упаковка обеспечит возможность трансдукции обоих маркеров Д /п и Лр . Поэтому для клонирования какого-либо гена достаточно лишь вставить небольшой фрагмент его ДНК в плазмиду-зонд, содержащуюся в линии хелперных клеток, суперинфицировать их космидной библиотекой (упакованной, как указано в разд. 2.2.8.5), индуцировать профаг в хелперных клетках и высеять их на чашки с Km и Ар. Колонии с двойной лекарственной устойчивостью должны в принципе содержать ген, клонированный в космиде, в которую интегрировала плаз-мида-зонд. [c.62]

Космиды довольно часто нестабильны и спонтанно перестраиваются или становятся меньше (это может происходило в 1—5% случаев). Чем это объясняется, установить трудно, и можно допустить любую из нескольких причин наличие кп-вертированных дупликаций, области гомологии в эукариотической ДНК с сильными прокариотическими промоторами, операторными участками и сайтами связывания репрессоров [7]. Мы идентифицировали космиды, обусловливающие замедление роста клеток-хозяев при выращивании культур, по-видимому, будет происходить обогащение клональной библиотеки делеционными производными космид, не влияющими на рост клеток. На практике мало что можно сделать с нестабильными космидами, за исключением попыток выделить и хранить полноразмерные молекулы из культуры, обогащенной делеционными вариантами. Для этого можно использовать упаковку in vivo и суперинфекцию на чашках (разд. 2.2.8.3—2.2.8.6). Препараты, полученные из фаголизатов, будут обогащены полномерными космидами, поскольку только такие космиды укладываются в рамки ограничений по размеру, характерных для реакции упаковки. Однако при этом могут быть упакованы и мультимеры делеционных производных, так что этот метод может оказаться неэффективным. [c.71]

Настоящая глава посвящена генетическим подходам к выделению, генноинженерному манипулированию и анализу индивидуальных космидных клонов или библиотек клонов. В ней представлены методики упаковки космидных клонов в лямбо-доидные фаговые частицы и отбора нужных космид (или плазмид) из полных библиотек путем гомологичной рекомбинации. Рассмотрены также способы модификации отобранных клонов или групп клонов с помощью вставок или замещений определенных последовательностей. [c.74]

ВВОДИТ свою ДНК в бактерию-хозяина. Те же реакции, приводящие к эффективной и избирательной упаковке космид в частицы фага Я, можно провести и in vivo [2—5]. В этом случае упаковку обеспечивает система, запускающаяся в бактериальной клетке либо при индукции профага в ответ на тепловую инактивацию термочувствительного репрессорного белка, либо при индуцировании клетки хелперным фагом. При этом способе существенно возрастают эффективность процессов переноса генетической информации между разными клетками и взаимопревращения различных (кольцевых и линейных с выступающими концами) форм ДНК (рис. 3.1). [c.75]

Упаковку космид in vivo можно применять при многих видах работ с космидными клонами и библиотеками. Основное достоинство данного подхода при амплификации библиотек — простота работы с упакованными космидами. Как и библиотеки, полученные на основе Я-векторов, космиды хорошо хранятся при 4 °С в виде фаговых суспензий, что позволяет легко оттитровать космидный препарат. При комнатной температуре препарат стабилен и хорошо выдерживает транспортировку. [c.76]

Третье достоинство упаковки in vivo — возможность использования ее для избирательного и высокоэффективного переноса космид между различными штаммами-хозяевами. Проводя последовательные циклы упаковки и повторного инфицирования, космиды ила космидные библиотеки можно легко (и избирательно) переносить между штаммами-хозяевами с различным генотипом при этом космиды будут постоянно или временно подвергаться воздействию других генетических элементов (плазмид, транспозонов). Поэтому упаковка in vivo представляет собой важный этап многих подходов к генетическим манипуляциям с [c.76]

КОСМИДНЫМИ клонами. Это особенно существенно для описанных ниже методов рекомбинации космид. В этом случае упаковка in yvo обеспечивает две независимые важные функции — перенос осмид между различными штаммами-хозяевами и селекцию космидных клонов, рекомбинировавщих с плазмидой-зопдом. [c.77]

Рекомбинационные эксперименты в аналитическом варианте, используемые, например, для интеграции или замены последовательностей в индивидуальных космидах (разд. 3.4), могут быть проведены по такой же методике с соответствующим уменьшением объемов (см. табл. 3.6 или 3.7). Упаковку in vivo можно осуществить путем индукции профага или с использованием суперинфекции. Мы обычно проверяем и очищаем рекомбинанты переупаковкой в аналогичном варианте (табл. 3.6), чтобы исключить варьирующий и труднообъяснимый фон колоний с двойной резистентностью, содержащих нерекомбинировавшие космидные и плазмидпые последовательности. [c.91]

Этот этап нужен, чтобы избавиться от ложных клонов, возникших в результате трансформации плазмидой-зондом или ведущих свое происхождение от клеток, переживших обработку хлороформом. На этой стадии происходит также очистка клонов и элиминация смешанных колоний, возникших при заражении клетки более чем одной космидой. В качестве альтернативы может быть использован метод упаковки in vivo с использованием суперинфекции (табл. 3.2). [c.93]

Фрагменты еще большего размера могут быть клонированы в космидах—векторах, объединяющих преимущества плазмид и фагов. Космиды—это плазмиды, содержащие специфические участки, называемые со8-сайтами, которые необходимы для упаковки ДНК фага X в капсид. Эти вектора могут поддерживаться в бактериальной клетке в плазмид-ной форме, но так как большая часть ДНК фага из космиды удалена, то соответственно увеличивается и возможная длина клонируемого фрагмента. Довольно обычными для космид являются вставки размером 30—50 т. п. н. Свойства векторов трех типов сравниваются в табл. 36.3. [c.40]

Космида. Плазмида, в которую введен специфический сайт фага Я. (со5-сайт), необходимый для упаковки in vitro плазмидной ДНК. [c.51]

Как уже упоминалось выше, фаговые векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК длиной 15-25 т.п.о. Однако этого явно недостаточно, чтобы клонировать целиком многие гены животных и растений, длина которых зачастую превышает 35-40 т.п.о. Требуемой емкостью обладают векторные молекулы, называемые космидами (рис. 9). Космиды представляют собой небольшие плазмиды, в которые in vitro введены соз-сшты ДНК фага X. Отсюда происходит название всего типа данных векторов ( 6)5mid). В ДНК нормальных фаговых частиц os-сай-ТЬ1 расположены на концах молекул, они разделяют мономеры фаговой ДНК в конкатемерах, объединяющих несколько соединенных голова к хвосту мономеров, которые являются предше- венниками зрелых фаговых ДНК перед упаковкой в фаговые Частицы. В таких конкатемерах соседние сш-сайты располагают- [c.83]

Стадия упаковки ДНК космид в фаговые частицы используется лишь для облегчения процесса введения рекомбинантных ДНК большого размера внутрь бактериальных клеток. Такой процесс имитирует проникновение фаговой хромосомы в бактерии во время фаговой инфекции. В случае космид сходство между их проникновением в бактериальные клетки и фаговой инфекцией на этом заканчивается. Однако сходство является более глубоким в случае векторов, называемых фазмидами. Фазмиды представляют собой векторные молекулы ДНК, которые содержат в себе генетические элементы плазмид и хромосом бактериофагов. Они могут обладать емкостью в отношении клонируемой ДНК, характерной для А,-векторов, и существовать в определенных условиях в бактериальных клетках в виде плазмиды или же упаковываться в фаговые частицы in vivo при изменении этих условий. [c.85]

Наиболее подходящие кандидаты на роль векторов — естественные репликоны небольших размеров ДНК плазмид и вирусов (в том числе и фагов), но непосредственно в этом качестве их используют ре 1КО. Обычно их предварительно модифицируют или комбинируют их части для того чтобы они отвечали определенным требованиям. Самые распространенные плазмидные векторы клеток Е. oli — плазмида pBR322 и ее специализированные производные. Для этих же клеток сконструированы фаговые векторы на основе ДНК фага X и нитевидных фагов. Разработаны векторы (космиды), позволяющие отбирать рекДНК путе г их упаковки in vitro в головки фага X Создаются векторы [c.188]

Космиды — это плазмидные векторы, в которые встроен участок генома фага Я, обеспечивающий возможность упаковки этой молекулы ДНК в фаговую частицу. Необходимыми компонентами космидного клонирующего вектора являются [c.105]

Космиды по существу являются плазмццными векторами, присвоившими tw-сайт фага к для осуществления эффективной упаковки in vitro. Истинными гибридами между плазмидой и фагом являются фазмцды—линейные дуплексные молекулы ДНК, концы которых представляют собой сегменты ДНК фага X, содержащие все гены, необходимые для литической инфекции, а средняя часть—линеаризованную плазмиду. Функции реп- [c.247]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология