Промоторная последовательность

К этим элементам относятся промоторные последовательности, с которыми связывается РНК-поли-мераза, и последовательности, влияющие на скорость инициации транскрипции благодаря связыванию со специфическими белками, репрессорами или активаторами (рис. 8.1 и разд. 3.2.в). Все гены прокариот транскрибируются с помощью единственной РНК-полимеразы, которая при своем функционировании связывается с сигма(а)-факто-рами, поэтому организация разных промоторов у прокариот одинакова (рис. 3.8). Все последовательности, входящие в регуляторную область, располагаются в основном на расстоянии 50 - 75 пар оснований до точки инициации транскрипции и лишь иногда элементы, ответственные за позитивную или негативную регуляцию, находятся еще дальше от этой точки либо в пределах транскрибируемого участка или даже за его З -концом. [c.21]

Несмотря на то что взаиморасположение операторной и промоторной последовательностей в опероне trp отличается от такового в /ас-опероне, общий механизм репрессии остается тем же связывание РНК-полимеразы и связывание репрессора являются взаимоисключающими событиями. [c.191]

По аналогии с прокариотами можно ожидать, что в инициации транскрипции эукариотических генов должны участвовать промоторные последовательности, расположенные в ДНК недалеко от точки инициации синтеза РНК (с 5 -конца данного гена). С использованием методов, описанных в гл. 9, удалось клонировать значительное количество структурных генов из различных эукариотических клеток и их вирусов. Сравнение 5 -фланкирующих последовательностей этих генов позволило выявить очень характерную А-Т-богатую последовательность, распо- [c.208]

Общая организация группы генов L-цепи показана на рис. 16.23. Число генов V точно неизвестно и находится в диапазоне 200-300. Каждый ген содержит примыкающую к структурной области промоторную последовательность, однако не транскрибируется до тех пор, пока не произойдет продуктивная перестройка ДНК, соединяющая его с одним из пяти генов J. Г ены Уи J разделяются короткими, одинаково организованными участками последовательности, которые содержат [c.241]

Промоторная последовательность определяет, какая именно цепь ДНК будет транскрибироваться [2] [c.256]

Молекула ДНК-зависимой РНК-полимеразы Е. соИ состоит из четырех субъединиц—двух идентичных (а-субъединицы) и еще двух — близких по размеру, но не идентичных (Р-и Р -субъединицы). Для осуществления полимеразной функции должен образоваться холофермент—комплекс так называемого кор-фермента, т. е. собственно РНК-полимеразы, с дополнительным белковым фактором (ст-фактор), способствующим более прочному связыванию полимеразы со специфической промоторной последовательностью ДНК. Бактерии продуцируют множество различных ст-факторов, каждый из которых функционирует в роли регулятора, модулирующего промоторную специфичность РНК-полимеразы. Появление различных ст-факторов коррелирует во времени с запуском различных комплексных программ экспрессии определенного набора генов в прокариотических системах, таких, как развитие [c.83]

В гл. 39 дано определение промотора как такого участка последовательности гена, с которым должна связываться РНК-полимераза, чтобы начать транскрипцию с соответствующего сайта. Промоторные последовательности точно определяют, где РНК-полимераза начнет транскрипцию. Решение вопроса [c.123]

Скорость репликации плюс- и минус-цепей стандартного VSV неодинакова в норме минус-цепи синтезируются в четыре раза быстрее, чем плюс-цепи. При изучении кинетики этого процесса выявили две стадии репликативного цикла. На ранних этапах инфекции плюс- и минус-цепи синтезируются в отношении 1, а на более поздних синтезируются преимущественно минус-цепи. Вместе с тем ДИ-частицы на протяжении всего инфекционного цикла синтезируют равные количества плюс- и минус-цепей. Ключ к пониманию механизма асимметричной репликации дает анализ концевых последовательностей обеих матриц. Первые 46—48 нуклеотидов на 3 - и 5 -концах РНК являются высококонсервативными, но они не идентичны у плюс-и минус-цепей стандартного вируса, что согласуется с различиями в скорости репликации цепей. Вместе с тем концевые последовательности у плюс- и минус-РНК ДИ-частиц идентичны на протяжении по крайней мере 46 нуклеотидов и соответствуют З -концевым последовательностям плюс-цепи стандартного вируса. Поскольку ДИ-частицы интерферируют со стандартным вирусом благодаря более эффективной конкуренции за лимитирующие факторы репликации и поскольку плюс-цепи стандартного вируса реплицируются более эффективно, чем минус-цепи, можно заключить, что преимущества в репликации обусловлены З -концевыми последовательностями плюс-цепей. Будучи локализованы на З -конце матрицы, они должны содержать промоторную последовательность для репликазы. Эксперименты по расщеплению РНК в присутствии белков с последующим олигонуклеотидным анализом указывают на то, что NS-белок связывается с теми последовательностями на З -конце стандартной минус-цепи, которые отличаются от таковых ДИ-матриц и стандартных плюс-цепей. Таким образом, если различия в первичной структуре обусловливают различия в прочности связывания репликазы, стандартная минус-цепь по сравнению с плюс-цепью и ДИ-матрицей содержит менее эффективный промотор. Это одно из объяснений различия в уровне репликации плюс- и минус-цепей. [c.431]

Псевдоген — участок ДНК, очень скудный по последовательности оснований с известным геном, но не выполняющий такой функции, либо из-за потери сигнализации трансляции (промоторной последовательности), либо несущий мутацию, которая предотвращает трансляцию. [c.356]

Другие а-факторы (например синтезируемые некоторыми фагами) также существенно изменяют специфичность РНК-полимеразы Е. соИ к промоторным последовательностям. [c.143]

Генетическая селекция in vivo может обеспечить способность организма к разложению специфического вещества. Однако подобные методики нуждаются в длительном периоде селекции (8—10 мес, как описано выше) и основываются на случайном наборе генетического материала для получения желаемой катаболической системы. Использование методов рекомбинантной ДНК дает экспериментатору возможность соединять вместе определенные катаболические последовательности и контролировать экспрессию специфических генов. Уровень экспрессии, определяемый in vivo, зависит от регуляторных механизмов, кодируемых плазмидными последовательностями, и мало что можно сделать, чтобы повлиять на выход отдельных ферментов. Однако можно получить повышенный уровень генного продукта, клонируя определенные гены в векторах по направлению транскрипции промоторных последовательностей. [c.334]

Первые гены, которые использовались для трансформации растений, были выделены из бактерий, и их нельзя было напрямую использовать для трансформации растительных клеток. Для того чтобы бактериальные гены транскрибировались в эукариотической клетке необходимо заменить их исходные бактериальные промоторные последовательности либо на промоторы растительных генов, либо на другие, которые могут инициировать транскрипцию в растительной клетке. Кроме того, необходимо присоединить к З -последовательности бактериального гена фрагмент, содержащий сигнал полиаденилирования. Такие модификации необходимы для того, чтобы эукариотическая РНК-полимераза могла транскрибировать бактериальную последовательность, и затем мРНК транслировала бактериальный белок в растительной клетке. [c.63]

Во всех случаях, когда предпринимались попытки обнаружить промоторную последовательность РНК-поли-меразы, предполагалось, что промотор окажется расположенным против хода транскрипции (считая от стартовой точки). Так продолжалось до тех пор, пока не был охарактеризован промотор для генов, кодирующих 58-РНК у X. laevis. У этих генов, транскрибируемых РНК-полимеразой III, промотор расположен в пределах транскрипционной единицы на расстоянии более чем 50 оснований правее стартовой точки по ходу транскрипции. Такое его расположение объясняет отсутствие сколько-нибудь очевидных консервативных последовательностей в участках, расположенных слева от стартовых точек генов, транскрибируемых РНК-полимеразой III. [c.154]

Одна из возможностей состоит в том, что фермент способен узнавать широкий диапазон промоторных последовательностей. Это не кажется невероятным, если учесть, что в промоторах, узнаваемых РНК-полимераза-ми других типов, консервативные участки очень малы по размеру. Возможно также, что фермент самостоятельно не способен узнавать промотор, а нуждается для этого во вспомогательном факторе. В этом случае необходимо существование различных факторов для каждого типа промотора. Действительно, оказывается, что РНК-полимераза III способна транскрибировать гены, кодирующие 5S-PHK, только в присутствии вспомогательного фактора. Это белок с мол. массой 37 000 дальтон, взаимодействующий с участком от -ь 45 до -ь 96. Данный белок (несколько копий которого должно связаться с ДНК, чтобы покрыть столь обширную область) одновременно служит двум целям, поскольку в ооцитах он также связывается с образовавшейся 5S-PHK. Рассматриваемый регуляторный белок не связывается с ДНК, кодирующей тРНК 1 Мы можем предположить, что в дальнейшем будет охарактеризован ряд аналогичных факторов, играющих важную роль в селекции промоторов. [c.155]

Способность включать фланкирующие последовательности хозяина аналогична свойству некоторых бактериальных транспозонов, хотя способность к включению может быть иногда обусловлена скорее наличием усилителя (enhan er), чем промоторными последовательностями. Активность провирусного генома, вероятно, зависит и от сайта, в котором произошла интеграция вируса в геном хозяина. [c.492]

На рис. 16.24 показана общая организация группы генов Н-цепи. Семейства генов Ju, D, и Vu расположены перед семейством генов Сд. Каждый из генов ц содержит собственную промоторную последовательность. Выбор экспрессии данного V-участка тяжелой цепи сопровождается двумя перегруппировками генов в ДНК объединением генов Уд и D с удалением промежуточной области ДНК и объединением VfjD и Jи, также с удалением промежуточной последовательности. Таким образом, возникает транскрипционная единица, с которой за счет альтернативного сплайсинга могут считываться ц- и 5-варианты тяжелой цепи данного типа. В сочетании с продуктами экспрессии образовавшихся транскрипционных единиц типа L,, или экспрессия генов и Я5 обеспечивает продукцию IgM и IgD. В дальнейшем на стадии терминальной дифференцировке В-лимфоцитов происходит так называемое переключение классов, которое настраивает клетку на продукцию того или иного из перечисленных в табл. 16.5 класса иммуноглобулинов. Это переключение сопряжено с третьей перестройкой ДНК, в ходе которой экспрессируемая область VaDJu объединяется с определенным Сн-участком, при этом удаляется промежуточная область ДНК. Каким образом в В-лимфоцитах происходит регуляция таких сложных перестроек ДНК, пока неизвестно. [c.244]

При клоиироваиш ДНК фрагмент, содержащий изучаемый ген, выявляют обычно с помощью радиоактивного ДНК-зонда или, после экспрессии гена в клетке-хозяине, - с помощью антител, обнаруживающих кодируемый этим геном белок. Затем клеткам, несущим данный фрагмент ДНК, предоставляют возможность размножаться и нарабатывать большое количество копий как самого гена, так и молекул его продукта. Для генноинженерных задач нуклеотидную последовательность такого клонированного фрагмента ДНК изменяют, присоединяют к другой последовательности ДНК, а затем снова вводят в клетки. Сочетание клонирования ДНК с генной инженерией вооружает клеточного биолога очень мощным инструментом исследования. В принципе возможно сконструировать ген, кодирующий белок с любой желательной аминокислотной последовательностью, и присоединить его к такой промоторной последовательности ДНК, которая позволит контролировать время и тип экспрессии гена Этот новый ген можно ввести либо в клетки, выращиваемые в культуре, либо в клетки зародышевого пути мыши или плодовой мушки. У трансгенных животных эффект экспрессии включенного гена можно наблюдать на многих различных клетках и тканях. [c.343]

Однако даже у мыши единичного онкогена обычно не достаточно для превращения нормальной клетки в раковую. Это отчетливо продемонстрировано на транегенных мышах. Можно сшить онкоген в виде фрагмента ДНК. взятого из вируса или опухолевой клетки, с подходящей промоторной последовательностью ДНК, и ввести полученную молекулу в ядро мышиной яйцеклетки. Такая рекомбинантная молекула ДНК часто встраивается в одн> из хромосом, в результате чего получается линия транегенных мышей, несущих онкоген во всех своих клетках. Этот онкоген может экспрессироваться во многих тканях или же лишь в некоторых избранных , в соответствии с тканевой специфичностью соединенного с ним промотора. Обычно у мышей, которым ввели таким способом онкогены туе или H-ras, экспрессирующие их ткани резко увеличиваются в объеме, разрастаясь до чрезмерной величины, а отдельные клетки со временем подвергаются дальнейшим изменениям и дают начало опухоли. И все же подавляющее большинство клеток трансгенной мыши, экспрессирующих туе- или H-ras-онкогены, опухолей не образуют, что говорит о недостаточности присутствия одного онкогена для опухолевой трансформации. [c.475]

Фаговые РНК-полимеразы во многих отношениях отличаются от полимераз клетки-хозяина. Они обычно имеют небольшую молекулярную массу (90—100 000 дальтон), представляют собой мапомеры и предъявляют весьма ограниченные, но тем не менее высокоспецифические требования к промотору. В противоположность этому РНК-полимераза Е. соИ представляет собой большую гетеромультимерную молекулу, способную инициировать синтез РНК с большого числа промоторных и подобных промоторным последовательностей [3]. На практике такие различия дают возможность использовать фаговые РНК-поли- [c.12]

Известно два основных нути желаемая структура может быть образована в один этап, нанример, в результате рекомбинации в пределах короткого района гомологии — при введении последовательностей, содержащихся в селекционной плазмиде, в специфический участок космидного клона (рис. 3.3). Примером может служить подстановка энхансерных или промоторных последовательностей в участок, предшествующий гену, введение селективных маркеров или индикаторных генов (устойчивости к неомицину, хлорамфеникол-ацетилтрансферазы, р-га-лактозидазы) под контроль промотора, который несет космида, или создание случайных составных сегментов, образованных гомологичными генами, принадлежащими космиде и плазмиде. При необходимости может быть использован перенос в клетки-хозяева, непермиссивные для репликации одного из этих компонентов, что позволяет элиминировать независимо реплицирующиеся плазмиды, возникающие в результате вторичных рекомбинационных событий. Сходным образом селекционные плазмиды с последовательностями, гомологичными космидному вектору, используют для введения специфических последовательностей (например, маркеров, селектируемых в эукариоти- [c.85]

Нуклеотидная и соответствующая аминокислотная последовательности лидерной зоны альфа-фактора и непосредственно примыкающая к ней 5 -промоторная последовательность гена показаны на рис. 7.3. Основные подходы к использованию лидерной последовательности альфа-фактора дрожжей для осуществления секреции гетерологичных генов описали Брейк и др. [23]. В структурном гене МРа-1 локализован Ятс П1-сайт, который в сайте процессинга молекулы-предшественника захватывает первый из двух повторов, соответствующих 01и-А1а. Это открывает традиционный, относительно несложный путь присоединения зрелых гетерологичных полипептидов к сигнальному пептиду альфа-фактора. Однако использование природного Я1П(11П-сайта может привести к внеклеточной секреции продукта, гетерогенного по Ы-концу большая часть молекул будет нести один или два дополнительных Ы-концевых дипептида С1и-А1а. Обусловлено это недостаточностью фермента дипептидил-аминопептидазы - продукта гена 51с13. Фермент этот элиминирует повторы С1и-А1а после того, как под действием продукта гена кех2 произойдет первичное эндопептидазное расщепление, полипептидной цепи предшественника за димером Ьуз-Аг . [c.216]

Аналогично этому были разработаны векторы, содержащие беспромоторные индикаторные гены с множественным линкером в 5 -области для встраивания промоторных последовательностей в качестве примера можно привести вектор для тестирования промоторов pGA482, который был описан в 1986 г. [3]. [c.29]

Изучаемую промоторную последовательность можно соединить с индикаторным геном путем транскрипционного либо трансляционного слияния. Для того чтобы получить транскрипционное слияние, область промотора индикаторного гена вырезают как можно ближе к ATG (кодон инициации трансляции), и затем этот ген непосредственно соединяют с изучаемым промотором. Если блок ТАТА нового промотора оказывается на соответствующем расстоянии (30—40 п. н.) от сайта ATG, то образуется химерный транскрипт, способный к нормальной трансляции с образованием фермента дикого типа (рис. 6.2). Если же необходимо получить трансляционное слияние, то ATG промоторной последовательности вместе с несколькими кодонами гена, который он обычно регулирует, соединяют с индикаторным геном, у которого в этом случае отсутствует свой собственный кодон ATG. Последний подход связан с двумя основными трудностями. Во-первых, соединение генов должно быть осуществлено таким образом, чтобы в транскрипте не происходило сдвигов рамки считывания и не возникали стоп-кодоны трансляции, что может приводить к образованию бессмысленных полипептидов или коротких фрагментов белка соответственно. Во-вторых, хотя и возможно обеспечить слияние таким образом, чтобы следующий за ATG кодон представлял собой первый кодон индикаторного гена, это может потребовать значительных усилий. Таким образом, в большинстве случаев на iN-KOHue гена растения подбирается (или конструируется) подходящий рестриктный сайт, который обеспечивает трансляционное слияние без нарушения рамки считывания. В таком случае индикаторный ген должен функционировать более нли менее нормально, причем к N-концу кодируемого им белка добавляется несколько лишних аминокислот. Если таким образом использовать AT и NPT-II, то лишние аминокислоты (см. например, [46]) не оказывают существенного влияния на активность ферментов. [c.309]

Рис. 6.17. Система слияния на основе гена GUS Л — строение основного вектора рБ1 101 для слияния с геном GUS. Приведен пример его использования с двумя промоторными последовательностями растений. 5 — нуклеотидная последовательность области слияния в полилинкере векторов, предназначенных для слияния с геном GUS. Инициаторные кодоны GUS выделены жирным шрифтом. Рестрикционные сайты ВатШ подчеркнуты.

Кодирующие последователь-вости для белков находятся в пределах большого прямоугольника промоторная последовательность-1 маленьком прямоугольнике слева. Места расщепления матрицы ферментами рестрикции указаны Ярелками. Под картой гена изоб-ршны три молекулы мРНК-продукты транскрипции по-разному расщепленных матриц. [c.113]

У грамположительных бактерий, как и у грамотрицательных, транскрипция осуществляется мультисубъединичным ферментом РНК-полимеразой, имеющим формулу /З/З ссг (см. 3.2). а-Фактор в этом комплексе определяет специфичность связывания кор-фермента РНК-полимеразы с промоторными участками на молекуле ДНК. В отличие от Е. соН в клетках В. subtilis обнаружено большое разнообразие а-факторов (табл. 10.5), которые обусловливают узнавание каждым типом холофермента специфичной промоторной последовательности на ДНК. [c.262]

Кольцевая ДНК вируса 8У40 — яркий пример экономного использования последовательности нуклеотидов для кодирования различных функций. Гены вируса 8У40 в значительной степени перекрываются (рис. 14.1). Область начала репликац перекрывается с промоторными последовательностями, направляющими раннюю (ре) и позднюю (ре) транскрипцию. [c.354]

Различия в эффективности транскрипции индивидуальных генов отчасти зависят от структуры их промоторов. Как прочность взаимодействия РНК-полимеразы с промоторной последовательностью, так и эффективность образования открытого про-моторного комплекса определяются конкретными нуклеотидными последовательностями -35- и -10-участков соответственно. Мутации в этих участках приводят к значительным изменениям способности многих промоторов обеспечивать инициацию транскрипции (рис. 3.10). В некоторых случаях инициацию транскрипции в малоэффективных промоторах облегчают вспомогательные белки, связываюшиеся с ДНК вблизи -35-последовательностей (разд. 3.11.в). Суть подобного феномена до конца не выяснена, но известно, что иногда белки, связываюшиеся с -35-последовательностью, увеличивают вероятность того, что она будет обнаружена РНК-полимеразой и свяжется с ней. Связывание белков-активаторов может привести также к изменению структуры ДНК и тем самым способствовать инициации транскрипции. Изменение топологической структуры ДНК —особенно увеличение числа отрицательных сверхвитков—также может приводить к повышению или снижению эффективности некоторых промоторов. [c.123]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология