Дрожжи реплицирующиеся плазмиды YRP

ДНК области начала репликации может быть выделена благодаря ее способности поддерживать репликацию любой последовательности ДНК, к которой она присоединена. Принцип такого подхода состоит в клонировании ДНК из области, несущей точку начала репликации, в такой молекуле ДНК, которая имеет подходящие генетические маркеры, но утратила точку начала. Подобная реконструкция приведет к образованию плазмиды, способной автономно реплицироваться лишь в том случае, если ДНК из области точки начала репликации будет содержать все необходимые для функционирования последовательности. (Такой подход был использован для идентификации центромерной или теломерной ДНК у дрожжей по их влиянию на выживаемость плазмиды гл. 28.) [c.398]

Рис. 9-57. Метод выявления автономно реплицирующихся последовательностей (ARS-элементов) у дрожжей Эти последовательности выступают в роли точек начала репликации, содержащие их плазмиды способны самостоятельно реплицироваться в хозяйской клетке, не включаясь в состав хромосом.

Указано также положение 55-рДНК в IGS, хотя это и несущественно для данного опыта. Гибридный ген. содержащий предполагаемый активатор транскрипции длиной 190 п.н. на 5 -конце межгенного спейсера или не содержащий его, включали непосредственно в хромосому дрожжей или вводили в клетку в составе реплицирующейся плазмиды. За транскрипцией гена следили по образованию Т7-подобной рРНК. [c.35]

Клонирование в дрожжах. Среди дрожжей наиболее полно изучен вид S. erevisiae. У этого вида в гаплоидных клетках содержится 17 хромосом, в их составе идентифицировано несколько сотен генов. Большинство штаммов дрожжей содержат автономно реплицирующуюся кольцевую ДНК длиной 2 мкм. Плазмида S pl S. erevisiae содержит около 6300 пар оснований и имеет 50—100 копий на клетку. Ее гибриды с плазмидами обычно и используют в [c.124]

Если вектор представляет собой плазмиду, реплицирующуюся независимо от хромосомы, то он должен содержать сайт инициации репликации, функционирующий в хозяйской клетке. Если же вектор предназначен для встраивания в хозяйскую хромосомную ДНК, то для обеспечения рекомбинации он должен нести последовательность, комплементарную определенному участку хромосомной ДНК хозяина (хромосомный сайт интеграции). Поскольку технически многие операции с рекомбинантными ДНК сложнее проводить в клетках эукариот, чем прокариот, большинство эукариотических векторов сконструированы как челночные. Другими словами, эти векторы несут два типа сайтов инициации трансляции и два типа селективных маркерных генов, одни из которых функционируют в Es heri hia oli, а другие — в эукариотических хозяйских клетках. Такие векторные системы экспрессии разработаны для дрожжей, насекомых и клеток млекопитающих. [c.136]

Вследствие различия в механизмах экспрессии генов у прокариот и эукариот, Е. oli может оказаться хозяином, мало подходящим для производства белков эукариотических организмов. Поэтому разработаны методы получения векторов для клонирования различных генов в клетках дрожжей - одноклеточных эукариот. Эти клонирующие векторы получают из репликонов дрожжевых клеток, так называемых 2 л-плазмид. Точки начала репликации этих векторов взяты у плазмид 2 л и у pBR322, в результате чего они могут реплицироваться как в дрожжевых клетках, так и в . соИ. Примером использования дрожжей для синтеза белков посредством клонирования генов эукариот может служить осуществленный таким образом синтез интерферона человека (интерферон-белок, обладающий противовирусным действием в клетках человека и, возможно, противоопухолевым действием вообще). [c.290]

Для того, чтобы молекула ДНК могла сформировать активную хромосому, она должна обладать способностью реплицироваться, разделяться при митозе и сохраняться в ряду клеточных поколений. Применение метода рекомбинантных ДНК к клеткам дрожжей позволило вьщелить и определить те элементы, которые превращают последовательность нуклеотидов в хромосому. Два из трех этих элементов были идентифицированы при изучении небольших кольцевых молекул ДНК, самостоятельно реплицирующихся в клетках дрожжей Sa haromy os erevisiae. Оказалось, что для репликации такой молекулы необходима специальная последовательность, которая выполняет роль участка инициации репликации ДНК (называемого также точкой начала репликации). В каждой хромосоме дрожжей таких участков несколько. Второй элемент, необходимый для функционирования последовательности ДНК как хромосомы, называется центромерой. Центромера соединяет содержащую ее молекулу ДНК с митотическим веретеном во время М-фазы (см. разд. 13.5.3). В каждой хромосоме дрожжей имеется только одна центромера. Если участок, выполняющий роль центромеры, встроить в плазмиду, то при делении каждая дочерняя клетка дрожжей обязательно получит одну из двух копий вновь реплицировавшейся молекулы плазмидной ДНК. [c.96]

Конъюгативный перенос бактериальных генов в клетки животных. Перенос генов во время конъюгации бактериальных клеток, когда мужские и женские клетки вступают в контакт друг с другом через объединяющий их цитоплазматический мостик, является широко распространенным и хорошо изученным генетическим явлением [224, 225]. Недавно была продемонстрирована возможность конъюгативного переноса ДНК из бактериальных клеток в культивируемые клетки животных [226]. В этой серии экспериментов В.Л. Ватерсу удалось показать, что гены устойчивости к антибиотикам, находящиеся в составе конъюгатив-ной плазмиды Е. соН, переносятся с низкой частотой в клетки яичников китайских хомячков СНО К1 из бактериальных клеток, давая возможность клеткам-реципиентам выживать на селективной среде в присутствии соответствующих антибиотиков. При этом не происходило поглощения бактериальных клеток клетками животных посредством эндоцитоза, и перенос имел место в присутствии ДНКазы в питательной среде, что исключало непосредственный захват ДНК клетками из культуральной жидкости. Чужеродная ДНК реплицировалась в клетках животных, а экспрессия генов генетических маркеров происходила лишь в том случае, если гены находились под контролем эукариотических промоторов. Хотя конъюгативный перенос генов бактерий в клетки дрожжей, а также растений (Ti-плазмиды) известен давно, обсуждаемая работа впервые продемонстрировала возможность непосредственного обмена генами между бактериями и клетками высших животных. В том случае, если данный процесс удастся оптимизировать, у генной инженерии появится дополнительная возможность введения очень больших молекул ДНК в клетки животных, в том числе и в целях генотерапии. [c.154]

Полагают, что автономно реплицирующиеся последовательност (ARS), сообщающие стабильность плазмидам дрожжей, являютс точками начала репликации. Однако доказать это весьма сложи Трудность состоит главным образом в выделении достаточно для анализа количества определенных реплицирующихся молек) [c.142]

Дж. Мейеринк с соавторами в 1979 г. обнаружили, что в ядре клеток дрожжей-сахаромицетов находится небольшое число молекул кольцевой двухцепочечной ДНК с контурной длиной около 3 мкм. Как выяснилось, данная плазмида представляет собой автономно реплицирующуюся полную копию одного хромосомного набора генов рибосомной РНК (см. рис. 12.2). В зависимости от штамма S. erevisiae плазмида З м присутствует в ядре в количестве от 1 до 19 копий. Полагают, что внехромосомные гены рибосомной РНК в виде автономной кольцевой ДНК могут быть промеж)ггочной [c.292]

Векторы УЕр-типа являются челночными плазмидами, способными реплицироваться как в клетках бактерии Е. oli, так и в дрожжах. Такой вариант векторов удобен в первую очередь тем, что наработку гибридных ДНК и ряд других манипуляций обычно легче осуществлять в бактериальных клетках. [c.298]

Смотреть страницы где упоминается термин Дрожжи реплицирующиеся плазмиды YRP : [c.135] [c.176] [c.171] [c.515] [c.135] [c.200] [c.200] [c.201] [c.404] [c.97] [c.211] [c.87] [c.172] [c.358] [c.66] [c.70] [c.219] [c.250] [c.96] [c.97] [c.227] [c.253] [c.254]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология