Трансфекция перенос генов

Хотя по причинам исторического характера описываемые нами опыты на эукариотических клетках были названы трансфекцией, они в точности соответствуют трансформации у бактерий. В этих экспериментах было не только установлено, что ДНК является у эукариот генетическим материалом, но и была доказана возможность переноса генов между разными видами с сохранением их [c.23]

Методы переноса генов потенциально приложимы к лечению наследственных аномалий человека. Например, ген, кодирующий нормальный гемоглобин, мог бы быть передан человеку, страдающему серповидноклеточной анемией, болезнью, вызванной присутствием аномальной (3-глобиновой цепи. Если нормальный (З-глобиновый ген будет введен в стволовые клетки, которые дают начало эритроцитам, то последние смогут синтезировать нормальный гемоглобин. Таким образом, индивидуум будет вылечен . Устранение генетических дефектов генома с помощью трансфекции нормальными генами представляется делом отдаленного будущего. Одна из основных трудностей - это низкая эффективность трансфекции. Даже в наиболее удачных случаях доля трансформированных клеток очень мала. Более того, пока трансфекция проводится с культурами клеток, а не с целыми тканями живых организмов, что потребуется для исправления генетических дефектов. [c.321]

Рис. 1. Перенос генов (трансфекция) с помощью мини-клеток.

Современные технологии позволяют вводить рекомбинантные ДНК в клетки любых типов и исследовать последствия экспрессии в них соответствующих генов. Этот процесс переноса генов в клетки высших организмов также, как и упомянутое выше введение ДНК бактериофагов в бактериальные клетки, называют трансфекцией. Трансфекция эукариотических клеток, как правило, включает два основных этапа перенос ДНК через клеточные мембраны в цитоплазму клеток и последующий их транспорт в ядра. Часто используемые приемы преодоления барьера [c.149]

Опыты с ДНК, выделенной из клеток опухолей, также свидетельствуют о существовании онкогенов. Метод обнаружения клеточных онкогенов получил название переноса генов или трансфекции . Он основан на том, что некоторые гены, присутствующие в опухолевых клетках, могут вызывать трансформацию нормальных клеток в культуре. Из опухолевых клеток выделяют ДНК, осаждают фосфатом кальция и добавляют к клеткам-реципиентам (обычно в этой роли выступает линия мыщиных фибробластов NIH/3T3). Через 1—2 недели под микроскопом наблюдают образование фокусов трансформации. Клетки, составляющие фокус, меняют свою морфологию из распластанных они становятся округленными. Из трансформированных клеток выделяют ДНК, и опыт повторяют. Так делают несколько раз, при этом уменьщается количество ДНК, не участвующей в переносе признака трансформации, и, следовательно, облегчается идентификация специфических генов (при помощи гибридизации по Саузерну (см. гл. 36)). С помощью этого метода было идентифицировано около 20 клеточных онкогенов некоторые из них сходны с геном га, вируса саркомы мышей. Эти клеточные онкогены либо вообще не отличаются от нормальных генов, либо имеют небольшие структурные особенности (см. ниже). В первом случае при опухолевом перерождении может меняться регуляция их экспрессии. [c.359]

Необходимо отметить, что следить за количеством и качеством доставленного внутрь клеток вектора обязательно только при разработке методики переноса гена посредством ДНК (DMGT). Наиболее важно оценить выживаемость протопластов, после трансфекции и, разумеется, наблюдать за экспрессией интернализованной ДНК. Общая стратегия заключается в определении условий, которые обеспечивают эффективное поглощение недеградированной ДНК и высокую выживаемость протопластов, а затем в анализе временной экспрессии векторной ДНК в популяции протопластов через несколько дней после обработки ПЭГ. Как только экспрессия маркерных генов будет оптимизирована, появится потенциальная возможность селекции отдельных трансформированных колоний. [c.212]

Препарат хромосом человека, не содержащий примеси клеток, может быть получен при соответствующей обработке, вскрывающей плазматическую и ядерную мембраны клетки. В семидесятых годах были разработаны методы фракционирования и проточной микрофлуоримет-рии, позволяющие осуществлять сортировку хромосом на фракции, содержащие индивидуальные хромосомы человека высокой чистоты (рис. 18.13). Когда свободные хромосомы добавляют к культивируемым клеткам мыши, то эти клетки могут захватывать целые хромосомы в процессе эндоцитоза. Внутри реципиентной клетки захваченные хромосомы обычно деградируют, распадаясь на фрагменты. Если такие фрагменты содержат центромерные области, то они могут поддерживаться как единое целое. Фрагменты, лишенные центромеры, могут транслоцироваться на мышиные хромосомы. В том и другом случае определенные человеческие гены будут экспрессироваться в гибридных клетках (рис. 18.14). Встраивание фрагментов в хромосому мыши происходит с очень низкими частотами, от 10 " до 10 на клетку. Встраиваемые фрагменты могут быть как очень мелкими, не видимыми в световой микроскоп, так и достаточно крупными, включая плечи хромосом и даже целые хромосомы. Такой перенос генетического материала от донора, сопровождающийся встраиванием в хромосомы реципиента, называется трансформацией (как у бактерий) или трансфекцией. [c.304]

За последнее десятилетие удалось осуществить молекулярное клонирование и характеризовать структуру множества генов млекопитающих. Функциональное содержание и механизмы регуляции этих генов исследуются теперь в экспериментах по переносу генетического материала. Рекомбинантные конструкции на основе последовательностей дикого типа или их мутантных производных вводят путем трансфекции в культивируемые клетки [I] для того, чтобы идентифицировать г ис-действующие регуляторные элементы и изучить физиологические последствия экспрессии генных продуктов. Однако,, даже если для интересующего гена и существует подходящая культивируемая тканевая система, возможности исследования генной экспрессии в таких экспериментах in vitro ограничены. В конце концов функции генов и закономерности их экспрессии следует изучать, исходя из сложности целого организма. Был разработан целый ряд методик, позволяющих вводить интересующие нас последовательности ДНК в клетки зародышевого пути мышей и других млекопитающих. Включившись в геном данного организма, такие чужеродные последовательности, называемые трансгенами, устойчиво наследуются в ряду поколений. Весьма важное значение имеет тот факт, что трансгены часто экспрессируются и вызывают изменения в системе тканевой специфичности, физиологических реакциях, а иногда во всей программе развития организма. Следовательно, открывается путь к изучению функциональной роли и регуляции экспрессии интересующих нас клонированных генов на уровне целого организма — в данном случае это так называемый трансгенный организм. [c.308]

При использовании DMGT донорная геномная ДНК обычно переносится вместе с плазмидой, кодирующей доминантный селективный маркер. Предварительная селекция, выявляющая включение плазмидной ДНК, позволяет получить 100-кратное обогащение клетками, содержащими интересующий нас клеточный ген. Аналогичный прием может быть использован и в MGT. Для проведения котрансфекции необходимое количество плазмидной ДНК добавляют к суспензии хромосом (п. 2) перед преципитацией хлоридом кальция (п. 3). Обычно мы добавляем плазмидную ДНК в количестве, достаточном для достижения соотношения 20 1 (по весу клеточная ДНК плаз-мидная ДНК). Селекцию проводим спутся 24 ч после хромосомной трансфекции. [c.25]

Присутствие внутриядерного Т-антигена можно легко выявить иммунофлуоресцентным окрашиванием. С помощью этого метода можно, в частности, определить долю инфицированных клеток в культуре, которая отражает титр вирусной заготовки. Данный метод можно использовать и в экспериментах по трансфекции, в которых переносу подвергается участок ДНК, содержащий ранние гены вируса, присоединенные к чужим или мутантным промоторам. В этих случаях экспрессия Т-антигена показывает эффективность функционирования встроенных промоторов. Фиксированные клетки обрабатывают вирусоспецифической противоопухолевой сывороткой. Сыворотку получают от хомяков, крыс или мышей, у которых развились опухоли в результате инъекции вируса или синген-ных трансформированных клеток. Вместо противоопухолевых поликлональных сывороток можно использовать моноклональ- [c.241]

Очень важной задачей теоретической и практической кардиологии является разработка способов стимуляции восстановления поврежденного миокарда, т.е. индукции миокардиальной регенерации и уменьшения рубца. Одна из стратегий исследований — перенос регуляторных генов, которые превращают фибробласты рубца в миобласты или трансфекция в кардиомиоциты генов, контролирующих рост клеток. Другим направлением является перенос в область повреждения фетальных скелетных и миокардиальных клеток, которые могли бы частично участвовать в восстановлении сердечной мышцы. В настоящее время проводятся эксперименты по трансплантации скелетной мышцы в сердце. Оказалось, что после трансплантации в миокарде образуются островки сокращающейся ткани и улучшаются функциональные показатели миокарда. Перспективным может бьпъ лечение с применением факторов [c.94]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология