Справочник химика 21

Химия и химическая технология

Статьи Рисунки Таблицы О сайте English

Плазмидные включение ДНК

    При наличии в клетке плазмиды часть энергетических ресурсов расходуется на ее репликацию, транскрипцию и синтез белков, которые она кодирует. При этом, как правило, многокопийные плазмиды требуют больше энергии, чем мал око-пийные, и в результате часть клеток в процессе роста популяции утрачивает плазмиды. Клетки, лишившиеся своих плазмид, обычно растут быстрее тех, в которых они сохранились, и в конечном счете оказываются в культуре преобладающими. По прошествии нескольких генераций это отражается на количестве синтезируемого продукта клонированного гена. Разработано по крайней мере два подхода к решению этой проблемы. В лабораторных условиях для сохранения плазмид клетки выращивают в присутствии антибиотиков или метаболитов, обеспечивающих рост только тех клеток, в которых есть плазмида. Однако добавление антибиотиков и каких-то других веществ в культуры, выращиваемые в больших объемах, или в промышленные ферментеры приводит к значительному удорожанию конечного продукта. Особенно важно, чтобы клонированные гены сохранялись, не утрачиваясь и не передаваясь другим микроорганизмам, в том случае, когда сконструированный микроорганизм предназначен для использования вне стен лаборатории. Он должен не только оставаться эффективным, но и быть экологически безопасным. Включение клонированной ДНК в хромосомную ДНК хозяйского организма позволяет обойтись без плазмид и избежать утраты плазмидных генов. [c.123]


    Включение ДНК в плазмидные и фаговые векторы [c.316]

    Высокий уровень накопления чужеродного продукта в клетках-хозяевах часто обусловливается инициацией транскрипции сильным промотором [2] и наличием в каждой клетке большого числа копий гетерологичного гена [3]. Однако чрезвычайно важно, чтобы экспрессия плазмидных генов была контролируемой, так как плазмиды сохраняются в клетках-хозяевах на протяжении многих поколений [4]. Это существенно, поскольку синтез рекомбинантных продуктов — метаболическая нагрузка на клетки [5] клетки, утратившие плазмиды, при размножении вскоре опережают в росте клетки, содержащие плазмиды. Строгий контроль экспрессии позволяет сначала получить большую биомассу клеток, не экспрессирующих гетерологичный ген, с последующим появлением небольшого числа поколений со включенной экспрессией этого гена. [c.96]

    В трансдукции плазмид могут принимать участие и специфически трансдуцирующие фаги. Если на плазмидной ДНК имеется соответствующий участок для включения профага, то при индукции лизогенных клонов можно обнаружить частицы, специфически трансдуцирующие фрагменты плазмидной ДНК, расположенные по флангам от места включения профага. Это представляет определенный интерес для анализа отдельных плазмидных генов, а также в генно-инженерных экспериментах. [c.101]

    В бактерии посредством Т. можно ввести также ДНК плазмид. Конечным результатом этого является возникновение клетки, несущей чужеродную плазмиду в автономном состоянии или включенную в состав хромосомы. Механизм проникновения в клетку плазмидной ДНК такой же, как и хромосомной. Однако возникновение однонитевой ДНК и др. процессы, сопутствующие поглощению, настолько уродуют плазмиды, что вероятность правильного восстановления кольцевой реплицирующейся формы низка (Т. клетки мономерными формами плазмид не эффективна). Поэтому употребляют мультимерные (состоящие из неск. плазмид) формы или плазмиды с прямыми повторами нуклеотидов, отчего шансы на сборку полноценной плазмиды повышаются. [c.626]

    Многие белки, продуцируемые Е. соН, накапливаются в клетках в форме нерастворимых биологически неактивных телец включения. И хотя из таких структур часто удается получать в небольших количествах биологически активный белок, для этого приходится проводить продолжительную солюбилизацию. Плохая растворимость белков in vivo часто обусловливается их неправильной укладкой, и эту проблему пытались рещить различными способами. Так, известно, что химерные белки, одним из компонентов которых является тиоредоксин, белок мол. массой 11,7 кДА, остаются в растворе, даже если на их долю приходится 40% суммарного клеточного белка. Имея это в виду, ген-мищень встроили в полилинкер сразу вслед за геном ти-оредоксина, так чтобы оба этих гена попали под контроль / "-промотора в плазмидном векторе Е. соИ (рис. 6.9). В хромосоме хозяйских клеток Е. соИ, использующихся в этой системе, присутствует генетическая конструкция, детерминирующая образование репрессора с — копия гена с1, находящаяся под транскрипционным контро- [c.114]


    К счастью, правильно спланировав эксперимент, можно минимизировать влияние метаболической перегрузки, оптимизировать выход рекомбинантного белка и повысить стабильность трансформированных хозяйских клеток. Например, нагрузку можно снизить, если использовать малокопийные плазмидные векторы. А еще лучше вообще отказаться от векторов и встроить чужеродную ДНК в хромосомную ДНК организма-хозяина. В этом случае не нужно заботиться об обеспечении стабильности плазмиды. Кроме того, клетке не приходится расходовать свои ресурсы на синтез ненужных продуктов, кодируемых маркерными генами устойчивости к антибиотикам. Синтез продуктов таких генов, входящих в состав плазмидных векторов наряду с генами-мишенями, является одной из основных причин метаболической перегрузки. Интеграция в хромосому особенно важна в тех случаях, когда используется сам рекомбинантный микроорганизм, а не синтезируемый им продукт. Уменьшению метаболической перегрузки помогает также применение сильных, но регулируемых промоторов. В таких случаях ферментацию проводят в две стадии. На первой из них, во время роста, промотор, контролирующий транскрипцию гена-мишени, выключен, а на второй, во время индукции, -включен. [c.128]

    Сегмент ДНК, кодирующий специфичный антиген (например, HB Ag), встраивают в плазмидный вектор непосредственно после клонированного ВКО-промотора, включенного в какой-либо несущественный ген ВКО, например ген тимидинкиназы (рис. 11.9, A). [c.239]

    Мандель и Хига [28] обнаружили, что обработка клеток Е. oli СаСЬ с последующими инкубацией на холоду и тепловым шоком приводит к включению ДНК, добавленной в среду. Их результаты дали толчок к разработке ряда приемов, позволяющих индуцировать состояние компетентности у бактерий различных родов и тем самым осуществлять трансформацию хромосомной и плазмидной ДНК, а также реализовать возможность трансфекции с помощью ДНК бактериофагов. [c.75]

    Одно из преимуществ описываемой процедуры получения трансгенных мышей по сравнению с другими методами состоит в том, что любую клонированную ДНК (в лямбоидном, плазмидном или космидном векторе) можно ввести в зиготу, где она интегрируется в геном и оказывается включенной в формирование зародышевого пути. Дополнительные манипуляции, такие, как переклонирование в специальные векторы и получение вирусных препаратов, здесь не требуются. Следует, однако, подчеркнуть, что эффективность микроинъекции в большой степени зависит от качества и свойств вводимой ДНК [15J. Ниже мы рассмотрим этот вопрос подробнее. [c.341]

    При использовании DMGT донорная геномная ДНК обычно переносится вместе с плазмидой, кодирующей доминантный селективный маркер. Предварительная селекция, выявляющая включение плазмидной ДНК, позволяет получить 100-кратное обогащение клетками, содержащими интересующий нас клеточный ген. Аналогичный прием может быть использован и в MGT. Для проведения котрансфекции необходимое количество плазмидной ДНК добавляют к суспензии хромосом (п. 2) перед преципитацией хлоридом кальция (п. 3). Обычно мы добавляем плазмидную ДНК в количестве, достаточном для достижения соотношения 20 1 (по весу клеточная ДНК плаз-мидная ДНК). Селекцию проводим спутся 24 ч после хромосомной трансфекции. [c.25]

    Не все клетки способны к трансфекции геномной ДНК с высокой частотой. Одни клетки вообще не трансфицируются, другие, например человеческие фибробласты, способны эффективно включать плазмидную ДНК и почти не включать геномную ДНК- Мышиные L-клетки обладают способностью к трансфекции геномной ДНК с высокой частотой и могут быть использованы в качестве положительного контроля в экспериментах по трансфекции ДНК новыми клеточными линиями. Возможно, что альтернативные способы прямого включения геномной ДНК, такие, как электропробой или липосомный перенос, смогут расширить список клеточных линий, способных к трансфекции. В противовес общепринятому мнению мы получали хорошие результаты по трансфекции L-клеток, используя преципи- [c.28]

    Основным свойством интегрирующих векторов является их способность стабильно встраиваться в геном клетки-хозяина. Это становится возможным благодаря наличию в таких векторах последовательностей нуклеотидов, гомологичных последовательностям геномной ДНК. В результате функционирования общей системы рекомбинации происходит объединение хромосомной и плазмидной ДНК интегрирующего вектора и стабильное включение всей векторной плазмиды в хромосому. Примером интегрирующего вектора служит плазмида pFH7 В. subtilis (рис. 12, а). Векторная плазмида содержит фрагмент ДНК умеренного бактериофага SP(3 и после попадания в клетки В. subtilis, лизогенные по данному бактериофагу, эффективно интегрируется в профаг. Поскольку плазмида содержит ген устойчивости к хлорамфениколу at, клетки приобретают этот признак. Индукция профага приводит к образованию фаговых частиц, трансдуцирующих такую плазмиду и ассоциированный с ней признак устойчивости к хлорамфениколу. Интеграция плазмиды SPp в бактериальную хромосому происходит по механизму гомологичной рекомбинации с участием гена гесЕ. Способность к интег- [c.101]


    Дальнейшие исследования показали, что в клетках Е. соИ при высоком уровне продукции как прокариотических, так и эукариотических белшв, превышающем 20 % суммарного клеточного белка, во многих случаях в цитоплазме образуются тельца включения — нерастворимые агрегаты (гранулы), хорошо видимые под фазово-контрастным микросшпом. Обнаружено, что гранулы, формируемые при сверхсинтезе белка, содержат и небольшое количество примесей, в состав которых входят различные белки клетки, рибосомные РНК и даже плазмидная ДНК. Эти примеси, по-видимому, со-осаждаются с белком, образующим тельца включения. В настоящее время разработаны достаточно простые методы выделения телец включения и перевода их в растворимое состояние. [c.154]

    Система pTi—Л. Ште/ас1еп5 дает замечательный пример включения прокариотической плазмидной ДНК в эукариотический геном в природных условиях. В действительности сама плазмида является, по-видимому, природной химерой. Она содержит два набора генов, один из которых активен в клетках бактерий, другой-в клетках растений. Регуляция работы генов, входящих в состав Т-ДНК, осуществляется с помощью элементов, оперирующих в клетках растений, тогда как гены в остальной части плазмиды находятся под контролем бактериальных промоторов. Следует отметить, что для образования опухоли требуются гены обеих групп. [c.274]


Библиография для Плазмидные включение ДНК: [c.191]   
Смотреть страницы где упоминается термин Плазмидные включение ДНК: [c.287]    [c.188]    [c.198]    [c.72]    [c.72]    [c.103]    [c.349]    [c.202]    [c.67]    [c.337]    [c.207]   
Биотехнология - принципы и применение (1988) -- [ c.316 , c.318 ]




ПОИСК





Смотрите так же термины и статьи:

включения



© 2025 chem21.info Реклама на сайте