Котрансфекция ДНК

Рис. 21.10. Образование HSV-вектора с помощью рекомбинации. Проводят котрансфекцию кдетки-хозяи-на плазмидой, которая содержит терапевтический ген, фланкированный последовательностями ДНК из вспомогательных областей HSV-генома, и ДНК HSV дикого типа. HSV-геном реплицируется в клеточно1М ядре по типу катящегося кольца , при этом между фрагментами ДНК HSV, входящими в состав плазмиды, и ДНК HSV дикого типа может произойти рекомбинация (штриховая линия). Молекулы ДНК HSV дикого типа и рекомбинантного HSV упаковываются в вирусные частицы, высвобождающиеся из клетки после лизиса. Вирусы размножают и проводят скрининг бляшек для идентификации рекомбинантных HSV. Полученные HSV-векторы хранят в условиях, исключающих их загрязнение HSV дикого типа.

Для получения аденовирусного вектора провели котрансфекцию клеточной линии, синтезирующей продукты аденовирусного гена El, двумя участками генома аденовируса (рис. 21.7). Один из них может существовать в виде плазмиды в Е. соИ и содержит вместо El-области терапевтический ген, фланкируемый нуклеотидными последовательностями аденовируса, а второй представляет собой молекулу ДНК аденовируса, которая лишена 5 -концевого участка, включающего Е1-область, и имеет перекрывающийся участок с несущей терапевтический ген плазмидой. Рекомбинация между двумя трансфицирующими фрагментами ДНК в области их перекрывания приводит к восстановлению полноразмерного аденовирусного гена, в котором вместо El-области находится терапевтический ген. Продукты гена El, поставляемые клеткой-хозяином, инициируют образование вирусных частиц, высвобождающихся из клетки в результате лизиса. Клонирующая емкость аденовирусного вектора [c.494]

Поскольку дефектные по тимидинкиназе ВКО спонтанно возникают с относительно высокой частотой (примерно 1 на 10 -10" вирусных частиц), нередко проводят котрансфекцию клеток каким-либо селективным маркером и нужным геном. Это облегчает разграничение спонтанных мутантов и мутантов, полученных с помощью гомологичной рекомбинации. В качестве селективного маркера обычно используют ген neo, кодирующий фермент неомицин-фос-фотрансферазу И и обеспечивающий устойчивость к аналогу канамицина G-418. Этот ген, в отличие от других селективных маркеров, остается стабильным при встраивании в геном ВКО. [c.240]

MOM без El-области и последовательности, ответственной за упаковку, провели котрансфекцию клетки-хозяина, экспрессирующей Е1-гены. Молекула ДНК аденовируса, дефектная по репликации и упаковке, поставляет гены для синтеза компонентов вируса, а продукт лигирования реплицируется и упаковывается в вирусные частицы. При этом около 99% высвобождаемых вирусных частиц содержат молекулу ДНК с терапевтическим геном (генами). С помощью центрифугирования их можно отделить от дефектных по репликации вирусов, которые все же образуются в незначительном количестве. ДНК-клонирующая емкость такой системы достигает 28 т. п. и. [c.496]

Описай кальцийфосфатный метод переноса онкогенных последовательностей в составе плазмидной и тотальной ДНК из опухолевых клеток. Описан способ получения фокусов морфологической трансформации на NLH38 клетках и эмбриональных фибробластах крысы, а также введение онкогенных последовательностей котрансфекцией с доминантными маркерами устойчивости. Библиогр. 19 назв. [c.317]

Отсутствие патогенности делает ААВ весьма перспективным вектором для доставки в организм человека терапевтических генов. Рекомбинантный ААВ получают с помощью котрансфекции клетки-хозяина, инфицированной каким-нибудь аденовирусом (вирусом-помощником), двумя плазмидами (рис. 21.8). Одна из них несет терапевтический ген, фланкированный инвертированными концевыми повторами (длиной от 125 п. н.) ААВ, а вторая - два его гена, гер и ap, ответственные за репликацию генома и синтез капсида соответственно. После [c.496]

Рис. 21.8. Вектор на основе аденоассопиированного вируса (ААВ). Проведена котрансфекция клетки-хозяина, инфицированной аденовирусом-помощником, двумя плазмидами, одна из которых содержит терапевтический ген (ТГ), фланкированный инвертированными концевыми повторами (ITR) ААВ, а другая — гены ААВ, ответственные за репликацию гер) и формирование капсида ap), которые находятся под контролем промотора р), и последовательность полиаденилирования (ра). Высвободившиеся после лизиса частицы рекомбинантного ААВ и аденовируса разделяют центрифугированием, а оставшиеся аденовирусные частицы инактивируют нагреванием.

Рекомбинантный HSV можно получить и с помощью котрансфекции клеток-хозяев, в которых вирус может реплицироваться, с помощью ДНК HSV дикого типа и плазмиды, которая содержит терапевтический ген, фланкированный последовательностями ДНК из вспомогательных участков HSV-генома. ДНК HSV дикого типа реплицируется в ядре клетки-хозя-ина, при этом в результате рекомбинации терапевтический ген может встроиться в HSV-re-ном. Затем частицы как рекомбинантного, так и дикого типа HSV упаковываются и высвобождаются из клеток. Доля рекомбинантных HSV в общем вирусном пуле очень мала, поэтому вирусы размножают, а затем с помощью ПЦР или гибридизации выявляют терапевтический ген в образовавшихся бляшках. Рекомбинантный вирус хранят в условиях, не допускающих его загрязнения HSV дикого типа (рис. 21.10). [c.498]

Котрансфекция двух и более маркеров дала дополнительные сведения о механизме трансфекции и расширила круг вопросов, которые могут быть решены с помощью этого метода. В случае трансфекции клеток 1к препаратами ДНК, содержащими очищенный ген 1к и геном фХ174, все трансформанты содержат обе донорные последовательности. Это наблюдение оказалось полезным, поскольку позволило вводить неселективные маркеры посредством котрансфекции с селектируемым маркером. [c.500]

Для получения стабильно трансформированных клеточных линий также используется стандартная процедура кальций-фосфатной трансфекции и затем селекция на доминантный маркер, который либо введен в состав самого ретровирусного вектора, либо находится в составе отдельной вспомогательной плазмиды, участвующей в котрансфекции. В качестве маркера обычно используют бактериальный ген neo, обеспечивающий устойчивость клеток млекопитающих к аналогу неомицина G418. Процедура трансфекции с последующей селекцией на устойчивость к G418 описана в табл. 9.2. [c.289]

При использовании DMGT донорная геномная ДНК обычно переносится вместе с плазмидой, кодирующей доминантный селективный маркер. Предварительная селекция, выявляющая включение плазмидной ДНК, позволяет получить 100-кратное обогащение клетками, содержащими интересующий нас клеточный ген. Аналогичный прием может быть использован и в MGT. Для проведения котрансфекции необходимое количество плазмидной ДНК добавляют к суспензии хромосом (п. 2) перед преципитацией хлоридом кальция (п. 3). Обычно мы добавляем плазмидную ДНК в количестве, достаточном для достижения соотношения 20 1 (по весу клеточная ДНК плаз-мидная ДНК). Селекцию проводим спутся 24 ч после хромосомной трансфекции. [c.25]

Совместный перенос (котрансфекция) и предварительная селекция [c.28]

В опытах по котрансфекции мы использовали смесь из 1 мкг плазмидной и 20 мкг геномной ДНК. Смесь готовили непосредственно перед добавлением хлорида кальция. [c.28]

На следующем этапе мы проводили котрансфекцию этих же трех линий клеток крысы плазмидами, содержащими ген пе/ВИЧ-1, находящийся под [c.153]

В рассмотренных работах гибридные вирусные геномы обычно конструировали in vitro и затем трансфицировали в чувствительные клетки млекопитающих. В редких случаях рекомбинантные аденовирусы отбирали после введения котрансфекцией вирусной ДНК и гибридной плазмиды в клетки млекопитающих и последующей гомологичной рекомбинации in vivo. Однако в последнем случае часто образовывались вирусные клоны с незапланированной структурой генома, поэтому требовался анализ относительно большого числа независимых вирусных клонов и их тщательная очистка от возможного загрязнения нерекомбинантным вирусом. [c.378]

В первых модельных экспериментах (1980 г.) было показано, что инактивированный in vitro делецией или встройкой экзогенной ДНК клонированный в плазмиде ген тимидинкиназы HSV-1 может быть легко перенесен в геном вируса простого герпеса котрансфекцией клеток ТК гибридной плазмидой и вирусной ДНК (tk ). Рекомбинантное вирусное потомство с фенотипом ТК селектировали на среде с АгаТ. [c.386]

В 1981 г Д. Влажны и Н. Френкель показали, что после трансфекции культуры клеток кролика смесью нативной ДНК вируса простого герпеса и мономерной повторяющейся единицы (8,3 тпн) дефектного HSV-1 образуется полноразмерный (около 150 тпн) дефектный геном, состоящий из тандемных повторов введенного фрагмента 8,3 тпн. По-видимому, такой вирусный геном получался в результате репликации мономерной единицы по механизму катящегося кольца. При этом нативная ДНК HSV-1 обеспечивала транс-функции, необходимые для репликации и созревания вирусной ДНК. Дефектный геном эффективно упаковывался в капсиды. Аналогичные результаты были получены в 1982 г, когда в клетки кролика котрансфекцией с нативной ДНК HSV-1 ввели повторяющийся 5й Л1-фрагмент (3,9 тпн) дефектного вируса простого герпеса штамма Patton. [c.388]

В лаборатории X. Темина в 1981-1983 гг. была разработана система клонирования генов в составе генома вируса некроза селезенки (SNV). Использована клонированная в плазмиде ДНК провируса SNV. В различные места этой ДНК встраивали фрагмент генома HSV-1, содержащий ген тимидинкиназы. Во всех случаях после встройки гена tk провирусная ДНК была неинфекционна из-за нарушения каких-либо функций, но интегрировалась в геном клеток ТК , обусловливая их генетическую трансформацию к фенотипу ТК При инсерци-онном повреждении LTR эффективность генетической трансформации была низкой, что доказывает важную роль LTR в процессе интеграции ретровирусной ДНК. Чтобы получить потомство гибридных вирусов SNV, в клетки кроме гибридной ДНК ввели котрансфекцией ДНК вируса ретикулоэндотелиоза для продукции ви-руса-помощника. В результате удалось получить в высоком титре потомство гибридного вируса SNV, при инфекции которым ТК -клеток цыпленка или крысы происходила их генетическая трансформация к фенотипу ТК" . Объединение в составе генома ретровируса легко селектируемого маркера генетической трансформации и любого другого гена позволяет упростить работу с гибридными ретровирусами. Данный подход успешно реализован в 1982 г при встройке в ДНК ретровируса SNV хромосомного гена а-глобина мыши или гена tk вируса простого герпеса. [c.403]

Поскольку ДНК этих вирусов имеет большие размеры и, как следствие, большое число мест гвдролиза рестриктазами, классическая генно-инженерная реконструкция вирусной ДНК in vitro обычно неприменима. В данном случае необходимо использовать подход, первоначально опробованный на вирусе простого герпеса. Целевой ген встраивают внутрь фрагмента вирусной ДНК, клонированного в составе векторной плазмвды. В результате получают конструкцию, в которой целевой ген фланкирован последовательностями ДНК из определенного района вирусного генома. Котрансфекцией в чувствительные клетки вводят нативную вирусную ДНК и гибридную плазмиду. В процессе рекомбинации по участкам гомологии, происходит встройка целевого гена в выбранный участок вирусного генома. [c.417]

АсКР6-8С, гидролизованной ВзиЗбХ, снижается на 2 порядка. Однако выход гибридных вирусов при котрансфекции линейной вирусной ДНК и целевой плазмидой увеличивается в 10 раз и достигает 9-23 % (вместо 0,8-2,3 % при обычной схеме эксперимента). Аналогичные результаты были получены и для гена белка р10. Таким образом, данный подход является общим и может быть использован при встройке чужеродных генов в любые заранее выбранные места вирусного генома. [c.423]

Схема, объясняющая полученные результаты, представлена на рис. 15.3. ДНК вируса ядерного полиэдроза способна реплицироваться лишь в кольцевой форме. Поэтому после котрансфекции гидролизованной линейной вирусной ДНК и плазмидой интеграции, перекрывающей это место гидролиза, выживают (спасаются) только те вирусные геномы, которые в клетке смогли замкнуться в кольцо. Существенная часть вирусных молекул переходит в кольцевую форму в результате их рекомбинации с плазмидой. [c.423]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология