Другие системы клонирования

ДРУГИЕ СИСТЕМЫ КЛОНИРОВАНИЯ [c.229]

В качестве примера рассмотрим три системы регулируемой экспрессии рекомбинантных генов в клетках Е. соН, которые получили широкое распространение. В одном случае для контроля экспрессии клонированных генов используют хорошо изученную систему регуляторных элементов лактозного оперона [123], в другом - систему промотор-репрессор-оператор фага [124], в третьем - промоторы и РНК-полимеразы бактериофагов [125]. Принцип регуляции экспрессии рекомбинантных генов в первых двух случаях один и тот же. В векторные молекулы вводятся регуля- [c.108]

В области биотехнологии молекулярная генетика создает фундаментальные основы для создания продуцентов различного рода веществ по двум направлениям. Во-первых, в ходе идентификации новых генов человека и других организмов выявляются все новые биорегуляторы и их рецепторы, которые можно использовать в качестве лекарственных препаратов для ветеринарии и медицины. Во-вторых, совершенствуются системы экспрессии различного рода генов в разнообразных клетках и организмах, что в свою очередь создает две перспективы создание клеток (бактериальных и эукариотических) и организмов (растений и животных), продуцирующих различного рода вещества, которые далее могут использоваться как лекарства, пищевые добавки, ферменты в заводских процессах или компоненты диагностикумов или вакцин, а также для создания организмов с улучшенными свойствами, например, трансгенных растений, устойчивых к засухам или имеющих повышенную переносимость к засоленным почвам, или животных, устойчивых к инфекциям. Наиболее впечатляющим достижением в области создания новых продуцентов можно назвать создание живых ферментеров - животных, секретирующих лекарственные препараты в молоко. Развитие технологий создания трансгенных животных делает процедуру создания такого ферментера достаточно рутинной. Эти технологии базируются на достижениях генетики соматических клеток и в последнее время намечается тенденция использования для этих целей систем клонирования животных. Можно сказать, что развитие молекулярной генетики перевело биотехнологию на уровень целых организмов, заложило предпосылки экологически чистых технологических процессов и интенсивных сельскохозяйственных технологий. Это особенно важно ввиду намечающихся демографических и экологических кризисов перенаселенной планеты. [c.8]

В настоящее время наиболее изучены два представителя этого рода Ps. aeruginosa (штамм РАО) и Ps. putida. Для генетического анализа псевдомонад используются конъюгативные плазмиды, способные мобилизовать перенос хромосомных генов, и неконъюгативные плазмиды. Разработаны методы индукции инсерционных или делеционных мутаций при внедрении транспозонов и других мигрирующих элементов. Система клонирования [c.164]

В лаборатории X. Темина в 1981-1983 гг. была разработана система клонирования генов в составе генома вируса некроза селезенки (SNV). Использована клонированная в плазмиде ДНК провируса SNV. В различные места этой ДНК встраивали фрагмент генома HSV-1, содержащий ген тимидинкиназы. Во всех случаях после встройки гена tk провирусная ДНК была неинфекционна из-за нарушения каких-либо функций, но интегрировалась в геном клеток ТК , обусловливая их генетическую трансформацию к фенотипу ТК При инсерци-онном повреждении LTR эффективность генетической трансформации была низкой, что доказывает важную роль LTR в процессе интеграции ретровирусной ДНК. Чтобы получить потомство гибридных вирусов SNV, в клетки кроме гибридной ДНК ввели котрансфекцией ДНК вируса ретикулоэндотелиоза для продукции ви-руса-помощника. В результате удалось получить в высоком титре потомство гибридного вируса SNV, при инфекции которым ТК -клеток цыпленка или крысы происходила их генетическая трансформация к фенотипу ТК" . Объединение в составе генома ретровируса легко селектируемого маркера генетической трансформации и любого другого гена позволяет упростить работу с гибридными ретровирусами. Данный подход успешно реализован в 1982 г при встройке в ДНК ретровируса SNV хромосомного гена а-глобина мыши или гена tk вируса простого герпеса. [c.403]

Другая важная задача — выведение трансгенных животных, устойчивых к заболеваниям. Потери в животноводстве, вызванные различными болезнями, достаточно велики, поэтому все более важное значение приобретает селекция животных по резистентности к болезням, вызываемых микроорганизмами, вирусами, паразитами и токсинами. Пока результаты селекщш на устойчивость животных к различным заболеваниям невелики, но обнаде-живающи. В частности, созданы популяции крупного рогатого скота с примесью крови зебу, устойчивые к некоторым кровепаразитарным заболеваниям. Установлено, что защитные механизмы от инфекционных заболеваний обусловлены либо препятствием вторжению возбудителя, либо изменением рецепторов. Вторжению возбудителей, равно как и их размножению, препятствуют в основном иммунная система организма и экспрессия генов главного комплекса гистосовместимости. Одним из примеров гена резистентности у мышей служит ген Мх. Этот ген, обнаруженный в модифицированной форме у всех видов млекопитающих, вырабатывает у Мх -мышей иммунитет к вирусу гриппа А. Ген Мх был вьщелен, клонирован и использован для получения трансгенных свиней, экспрессирующих ген Мх на уровне РНК. Однако данные о трансляции Мх-протеина, обусловливающего устойчивость трансгенных свиней к вирусу гриппа А, пока не получены. Ведутся исследования в целях получения трансгенных животных, резистентных к маститу за счет повышения содержания белка лакто-ферина в тканях молочной железы. На культуре клеток из почек трансгенных кроликов было показано, что клеточные линии, содержащие трансгенную антисмысловую РНК, имели резистентность против аденовируса Н5 (Ads) более высокую на 90 — 98% по сравнению с контрольными линиями клеток. Л. К. Эрнст продемонстрировал также устойчивость трансгенных животных с геном антисмысловой РНК к лейкозу крупного рогатого скота, к заражению вирусом лейкоза. [c.130]

Молекулярная биотехнология — это увлекательнейшая область научных исследований, с появлением которой произошел настоящий переворот во взаимоотношениях человека с живой природой. В ее основе лежит перенос единиц наследственности (генов) из одного организма в другой, осуш ествляемый методами генной инженерии (технология рекомбинантных ДНК). В большинстве случаев целью такого переноса является создание нового продукта или получение уже известного продукта в промышленных масштабах. В ч. I мы познакомим читателя с концепциями молекулярной биотехнологии и теми микроорганизмами, которые в ней используются, с основами молекулярной биологии и методологией рекомбинантных ДНК. Будут описаны такие методы, как химический синтез генов, полимеразная цепная реакция (ПЦР), определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) ДНК. Помимо успешного клонирования нужного гена очень важно обеспечить его правильное функционирование в организме нового хозяина, поэтому мы остановимся также на способах оптимизации работы клонированных генов в про- и эукариотических системах. И наконец, мы рассмотрим, как можно улучшить свойства конечных продуктов, модифицируя клонированные гены путем введения в них специфических нуклеотидных замен (мутагенез in vitro). В целом материал, изложенный в первой части, служит фундаментом, который позволяет понять различные аспекты конкретных применений молекулярной биотехнологии. [c.13]

Рис. 6.4. Двухплазмидная система, позволяющая контролировать работу р -промотора фага X путем регуляции синтеза с1-ре-прессора с помощью триптофана. Ген репрессора с вместе с триптофановым промотором (р trp) находятся в одной плазмиде, а p -пpoмoтop и клонированный ген - в другой. Стрелками указано направление транскрипции. А. В отсутствие триптофана в среде ген с1 транскрибируется и транслируется, репрессор с1 связывается с р -промотором и блокирует транскрипцию клонированного гена. Б. В присутствии триптофана ген с1 репрессируется, его продукт не синтезируется, поэтому клонированный ген транскрибируется и транслируется.

Для синтеза разнообразных белков, кодируемых клонированными генами, использовались дрожжи S. erevisiae. Их генетика хорошо изучена, а кроме того, их можно выращивать в больших ферментерах. Чтобы упростить очистку белков, были сконструированы векторы, обеспечивающие их секрецию. С помощью S. erevisiae было получено множество самых разных аутентичных белков. Однако многие рекомбинантные белки в этой системе не подвергались носттрансляционной модификации, к тому же их выход зачастую был недостаточно высок. Поэтому были предприняты попытки разработать другие дрожжевые системы синтеза рекомбинантных белков. [c.154]

Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ПЦР-амплификации Более простой и быстрый метод получения больших количеств мутантных генов, альтернативный системе с использованием фага М13, -сайт-специфический мутагенез в сочетании с полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Один из вариантов этого подхода состоит в следующем. Ген-мишень встраивают в плазмидный вектор (рис. 8.4) и помещают препарат в две пробирки. В каждую из них добавляют по два специфических праймера для ПЦР 1 и 2 в одну пробирку, 3 и 4 - в другую. Праймеры 2 и 3 полностью комплементарны одному из участков клонированного гена или прилегающей к нему последовательности, а 1 и 3 комплементарны другому участку, но содержат один некомплементарный нуклеотид и гибридизуются с разными цепями, так что в результате происходит замена обоих нуклеотидов данной пары. Положение сайтов гибридизации праймеров 1 и 2 в одной пробирке и 3 и 4 - в другой таково, что ПЦР-продукты в разных пробирках имеют разные концы. По окончании ПЦР содержимое пробирок объединяют и проводят денатурацию, а затем ренатура-цию. Поскольку концы амплифицированных молекул ДНК из двух пробирок неодинаковы, одноцепочечные ДНК из разных пробирок ассоциируют с образованием кольцевьгх молекул с [c.163]

Для генной терапии рака разработаны также комбинированные подходы, использующие две разные системы генов. В одном из них сочетаются G V-HSVi -терапия и генная иммунотерапия (рис. 21.12). Одну часть опухолевых клеток трансдуцируют геном HSV/Л, другую -клонированной кДНК (или геном) одного из цитокинов. Цитокины (интерлейкин-2, интер-лейкин-12 и другие) играют роль сигнала, мобилизующего клетки иммунной системы и стимулирующего иммунный ответ. Показано, что опухолевые белки, которые высвобождаются из клетки, уничтоженной в результате терапии с помощью гена самоубийства , взаимодействуют с иммунными клетками, привлекаемыми к месту локализации опухоли цитокином, и запускают противоопухолевую иммунную реакцию. Кроме того, противоопухолевые антитела, поступая в кровоток и циркулируя по всему организму, предотвращают появление метастазов. [c.503]

Двухплазмидная система Agroba terium, предназначенная для переноса участка Т-ДНК, несущего клонированные гены, в растительные клетки. Гены вирулентности локализованы на одной плазмиде, а встроенный участок Т-ДНК — на другой. [c.544]

Бинарный вектор. Другой, более простой и поэтому более часто применяемый метод введения чужеродной ДНК заключается в использовании бинарных векторов. Как уже упоминалось, для заражения и трансформации растительных клеток агробактериям необходима vir-o6-ласть, ответственная за перенос ДНК, и прямые повторы, ограничивающие район Т-ДНК. Более того, угУ-область и пограничные повторы Т-ДНК не обязательно должны находиться в одной плазмиде. Система бинарных векторов основана на том, что в агробактериальной клетке, используемой для трасформации растений, одновременно находятся две плазмиды. Одна содержит область пограничных повторов Т-ДНК, а другая — v/r-область. Обе плазмиды могут независимо реплицироваться в клетках агробактерии, однако, поодиночке не могут приводить к трансформации растений. При этом плазмида, несущая Т-ДНК, содержит в своем составе фрагменты плазмиды Е. соИ (в том числе и точку начала репликации), что позволяет проводить все манипуляции по клонированию в клетках Е. соИ и намного упрощает весь процесс. Аналогично коинтегра-тивному вектору нужный ген (целевой) и ген селективного маркера встраиваются в область Т-ДНК, и затем такая рекомбинантная плазмида вводится в клетки агробактерии, которые уже несут другую плазмиду с угг-областью. В отличие от коинтегративных векторов не происходит гомологичной рекомбинации между двумя плазмидами и их объединения в единую векторную молекулу. Белки, экспрессируемые уг>-генами одной плазмиды, вырезают и встраивают в растительный геном области Т-ДНК с чужеродными генами другой плазмиды. В настоящее время такие бинарные векторы наиболее часто используются для трансформации растительных клеток. [c.56]

Альтернативные методы скрининга космидных библиотек, описанные в гл. 3, предполагают селекцию космидных клонов с использованием феномена гомологичной рекомбинации in vivo. Остальные главы книги посвящены вопросам, связанным с экспрессией клонированных генов. Для многих белков млекопитающих удалось осуществить высокопродуктивную внутриклеточную экспрессию в Е. oli. Однако гетерологические белки, локализующиеся в цитоплазме, часто образуют трудно растворимые агрегаты, что значительно осложняет получение нативного продукта. В гл. 4 описаны эффективные способы выделения активных растворимых продуктов из нерастворимых белков цитоплазмы Е. соИ. Вероятность деградации специфическими бактериальными протеиназами многих эукариотических белков, синтезируемых в Е. oli, может быть существенно снижена, если их экспрессировать в виде гибридных белков. Такие составные белки, в которых бактериальный компонент обычно представлен -галактозидазой, можно использовать в качестве иммуногенов для получения антисыворотки и моноклональных антител к клонированному эукариотическому белковому домену. Эти вопросы >ассматриваются в двух главах — одна посвящена получению поликлональной антисыворотки, а другая — методам гибридной технологии. В последующих главах книги описаны современные эукариотические экспрессирующие системы в гл. 7 — дрожжевая, далее в трех главах — системы на основе культивируемых клеток млекопитающих и трансгенные животные. В частности, описана система экспрессии с использованием векторов, которые несут гены, обеспечивающие возможность их индуцибельной амплификации это позволяет снимать токсическое действие антибиотиков, введенных в культуральную среду. Клонированные в таком векторе гены также [c.8]

ЦЫ В присутствии подходящих хелперных компонентов. Подобные векторы по сравнению с векторами других типов имеют важные преимущества — простоту, и, судя по нащему опыту, позволяют получать вирусные препараты со стабильно высоким титром и устойчивой экспрессией клонированного гена. Более сложные векторные системы могут оказаться более универсальными, однако часто их использованпе наталкивается на трудности, связанные с исстабильностью или низким уровнем экспрессии. [c.280]

За последнее десятилетие удалось осуществить молекулярное клонирование и характеризовать структуру множества генов млекопитающих. Функциональное содержание и механизмы регуляции этих генов исследуются теперь в экспериментах по переносу генетического материала. Рекомбинантные конструкции на основе последовательностей дикого типа или их мутантных производных вводят путем трансфекции в культивируемые клетки [I] для того, чтобы идентифицировать г ис-действующие регуляторные элементы и изучить физиологические последствия экспрессии генных продуктов. Однако,, даже если для интересующего гена и существует подходящая культивируемая тканевая система, возможности исследования генной экспрессии в таких экспериментах in vitro ограничены. В конце концов функции генов и закономерности их экспрессии следует изучать, исходя из сложности целого организма. Был разработан целый ряд методик, позволяющих вводить интересующие нас последовательности ДНК в клетки зародышевого пути мышей и других млекопитающих. Включившись в геном данного организма, такие чужеродные последовательности, называемые трансгенами, устойчиво наследуются в ряду поколений. Весьма важное значение имеет тот факт, что трансгены часто экспрессируются и вызывают изменения в системе тканевой специфичности, физиологических реакциях, а иногда во всей программе развития организма. Следовательно, открывается путь к изучению функциональной роли и регуляции экспрессии интересующих нас клонированных генов на уровне целого организма — в данном случае это так называемый трансгенный организм. [c.308]

Выбор методики получения вирусного препарата определяется целью дальнейшего исследования. Для изучения круга хозяев, серологических свойств, а также в качестве инфекционного материала можно использовать и неочищенные препараты вируса [2]. В качестве антигена или иммуногена [3], для клонирования и секвенирования вирусной РНК [4] и получения матричной РНК (мРНК), транслируемой в бесклеточных системах, необходимо иметь высокоочищенный вирус, не содержащий контаминантов клеточного или другого происхождения. Для изучения цикла репродукции вируса в зараженной клетке, характеристики полиовируса методом олигонуклеотидного картирования РНК [6, 7], анализа вирионных белков [8] и в ряде иммунологических исследований [9] применяют вирус, меченный радиоактивным изотопом. [c.44]

Системы рестрикции-модификации типа II устроены наиболее просто [74, 75]. В таких системах модифицирующая ДНК-ме-тилтрансфераза функционирует в виде свободного мономера, а эндонуклеаза рестрикции - в виде димера, причем эти два фермента не зависят друг от друга. Рестриктазы типа II узнают специфические последовательности нуклеотидов в точке расщепления ДНК или непосредственной близости от нее, они активны в присутствии ионов Mg2+ без каких-либо дополнительных кофакторов и чаще всего используются при молекулярном клонировании, а также в ДНК-диагностике. [c.50]

Регуляторные части генов, а также продукты их экспрессии, мРНК и белки, распознаются соответствующими ферментными системами организма и обеспечивают упорядоченную экспрессию структурной части гена. При этом регуляторные участки генов и промежуточных продуктов их экспрессии, как правило, высокоспецифичны в отношении своих природных генетических эффекторов (РНК-полимераз, рибосом, факторов транскрипции и трансляции, белковых факторов сплайсинга, ферментов, осуществляющих посттрансляционные модификации полипептидов, и т.п.), и чаще всего они не могут эффективно функционировать в гетерологичном генетическом окружении. Очевидно, что при конструировании высокоэффективных экспрессирующих векторов необходимо, прежде всего, учитывать особенности структуры регуляторной части рекомбинантного гена, исходя из того, в каких генетических условиях клонированный ген будет экспрессироваться. Однако не только регуляторные последовательности генов являются препятствием для высокоэффективной экспрессии чужеродных рекомбинантных генов. Как уже было отмечено, структурные части генов про- и эукариот фундаментально отличаются друг от друга по наличию у последних внутри генов интронов. Следовательно, гены эукариот не могут эффективно экспрессироваться в бактериальных клетках, поскольку у прокариот отсутствуют соответствующие системы сплайсинга. Кроме того, у предшественников эукариотических мРНК не может осуществиться в бактериальных клетках и правильный процессинг 3 - и 5 -концевых некодирующих последовательностей. Даже такой [c.106]

В клетках Е. соН (и других бактерий) транскрипция большинства генов носит регулируемый характер, что обеспечивается системой белков-репрессоров и активаторов, а также низкомолекулярных эффекторов, которые главным образом влияют на взаимодействие РНК-полимеразы с транскрибируемыми генами 119-121]. Необходимость регулирования экспрессии генов в генной инженерии диктуется прежде всего тем, что сверхэкспрессия клонированных генов в клетках-продуцентах рекомбинантных белков при использовании сильных конститутивных промоторов может отрицательно сказываться на их жизнеспособности, поскольку промежуточные и конечные продукты экспрессии часто обладают цитотоксическим действием [122]. В этом случае сверхэкспрессия клонированных генов сопровождается снижением скорости или даже полной остановкой роста бактериальных или иных клеток. Для предотвращения этих эффектов используются генно-инженерные конструкции, в которых экспрессия клонированных генов в значительной степени подавлена (репрессирована) на ранних фазах роста культуры рекомбинантных клеток и может быть дерепрессирована в любой нужный момент времени. [c.108]

К другим запланированным перестройкам относятся процессы, с помощью которых прокариоты отвечают на изменение окружающей среды, дрожжевые клетки переключают тип спаривания, а трипаносомы уклоняются от иммунного ответа хозяина. В некоторых системах (гены рибосомных РНК Xenopus и гены, кодирующие белки хориона у D. melanogaster) для удовлетворения потребности в генных продуктах происходит массовая амплификация специфических генов. Известны случаи, когда, напротив, наблюдается массовая утрата ДНК. У некоторых простейших, например у Tetrahymena, геном зародышевой линии заключен в микронуклеус, а гены экспрессируются в соматическом макронуклеусе. При переходе в макронуклеус может утрачиваться 90% генома, поскольку из ДНК исключаются почти все повторяющиеся последовательности. У множества многоклеточных беспозвоночных, в том числе у некоторых нематод, насекомых и ракообразных, большая часть высокоповторяющихся последовательностей в соматических стволовых клетках утрачивается, но в клетках зародышевой линии сохраняется. Этот феномен впервые наблюдали под микроскопом в 1887 г. как димину-цию хромосом во время развития нематод. Таким образом, утверждение, что каждая клетка целого организма имеет ту же ДНК, что и оплодотворенное яйцо, из которого она возникла, не совсем верно. Тем не менее вклад специфических перестроек ДНК в процесс дифференцировки соматических клеток, по-видимому, невелик подавляющее большинство уже клонированных генов имеют одинаковую структуру и в клетках зародышевой линии, и в соматических клетках. [c.358]

Система для секвенирования ДНК методом дробовика , основанная на разработанном одноцепочечном векторе, несущем удобный полилинкер, вызвала к жизни способ получения небольших фрагментов ДНК для их последующего клонирования с помощью частощепящих рестрикционных эндонуклеаз с тетрануклеотидными сайтами узнавания (рис. 8.4) [Messing et al., 1981]. Преимуществом этого способа можно считать относительную легкость этапа лигирования при условии использования рестрикционных эндонуклеаз, образующих фрагменты ДНК с липкими концами. Что касается лигирования рестрикционных фрагментов ДНК, несущих тупые концы, то и в этом случае не требовались дополнительные этапы, предшествующие лигированию, в отличие от других методов получения коротких фрагментов ДНК, рассматриваемых ниже. Главный недостаток данного подхода заключается в том, что сайты используемых рестрикционных эндонуклеаз могут быть расположены не очень равномерно и, таким образом, существует вероятность получить какой-нибудь субклон, несущий вставку довольно крупного размера, не позволяющую осуществить ее прочтение за один эксперимент. [c.241]

Смотреть страницы где упоминается термин Другие системы клонирования: [c.146] [c.147] [c.229] [c.233] [c.227] [c.191] [c.191] [c.89] [c.115] [c.371] [c.154] [c.210] [c.466] [c.7] [c.139] [c.228] [c.70] [c.49] [c.174] [c.77] [c.115] [c.400] [c.237] [c.280] [c.71] [c.221] [c.311] [c.93]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология