Фермент образование комплексов, кинетические

Ферментативная реакция — это, как правило, многостадийный процесс, в котором на первой стадии образуется комплекс между ферментом и субстратом (комплекс Михаэлиса), Чаще всего эта стадия представляет собой сорбцию субстрата на ферменте, обусловленную, например, их гидрофобным, полярным и (или) ионным взаимодействием (см, гл. I), На образование комплекса Михаэлиса, предшествующее химическому взаимодействию, указывают многочисленные экспериментальные данные, в том числе и кинетические (см, гл. V и VI) некоторые фермент-субстратные комплексы были выделены в чистом виде [1]. Возникает вопрос, в какой мере способствует (и способствует ли) образование фермеит-субстратного комплекса ускорению катализируемой реакции. [c.34]

Обратим внимание, что образование промежуточного фермент-субстратного комплекса (комплекса Михаэлиса) само по себе вовсе не оказывает влияния на ускорение ферментативной реакции (в кинетическом режиме второго порядка, т. е. при [НУ] С Кз)- Дело в том, что концентрация стабилизированного пере- [c.40]

Чтобы определить путь, по которому протекает на самом деле образование мостикового комплекса, необходимо исследовать начальную скорость реакции и скорости связывания лиганда и металла, причем образование мостикового комплекса фермент — металл — лиганд должно протекать в кинетически контролируемой стадии. Однако до сих пор лишь для немногих систем проведено столь детальное кинетическое исследование. Для пируваткиназы из мышц [35, 38, 39] данные, описывающие механизм образования комплексов мостиковых металлов с ФЕП и АДФ, хорошо согласуются со всеми тремя возможными путями их образования (ср. гл. 18). Эти данные противоречат предположению [16] о том, что все комплексы нуклеотидов с ферментами, в которых принимают участие ионы двухвалентных металлов, образуются в результате взаимодействия фермента с комплексом металл — лиганд [уравнение (3)]. [c.448]

Определение абсолютной концентрации активных центров фермента из кинетических данных. В предыдущих разделах была рассмотрена кинетика ферментативных реакций в условиях избытка субстрата по сравнению с ферментом ([S]q [Elg). Рассмотрим теперь случай, когда концентрация субстрата сравнима по величине с концентрацией. фермента ([Slg [Е] ), и выведем уравнение для скорости ферментативной реакции, протекающей по двухстадийному мез анизму при условии быстрого установления равновесия на стадии образования фермент-субстратного комплекса [c.232]

Рентгеноструктурные исследования показали, что помимо серина-195 в активный центр входят также остатки гистидина (Н1з-57) и аспарагиновой кислоты (А5р-102). Другой остаток гистидина (Н1з-40) не участвует в катализе. Фермент обладает специфичностью к ароматическим аминокислотам. Эфиры ароматических аминокислот — хорошие субстраты этого фермента, и для большинства кинетических исследований в качестве субстратов использовались такие эфиры. Фермент расщепляет пептиды, освобождая карбоксильную группу ароматических аминокислот. После образования комплекса Михаэлиса единственный реакционноспособный 5ег-195 вначале ацилируется, образуя ацилферментное промежуточное соединение с субстратом. Превращение комплекса Михаэлиса в ацилфермент происходит сначала путем образования тетраэдрического интермедиата (разд. 4.4.1), и наконец происходит гидролиз ацилфермента при атаке молекулой воды, так что ацилированный продукт обычно не накапливается. [c.220]

Это уравнение известно как уравнение Михаэлиса и широко используется прежде всего в кинетических исследованиях реакций, катализируемых ферментами. Однако оно в равной мере применимо для любого случая катализа, происходящего по механизму образования комплекса катализатор—субстрат. [c.328]

Еще одну важную кинетическую характеристику свойств фермента, его качества дает нам энергия активации. Понятие активация давно существует в химии. При химической реакции активация происходит путем образования специфического, активированного комплекса, обладающего повышенной реакционной способностью, а в ферментных реакциях — путем образования комплекса фермент — субстрат (комплекс Михаэлиса). Однако [c.55]

Хотя в нашем распоряжении имеются самые разнообразные убедительные кинетические доказательства реальности фермент-субстратных комплексов, подтверждающие их прямые данные были получены лишь в сравнительно небольшом числе случаев. Однако именно такие прямые данные имеют реп ающее значение, так как они окончательно доказывают образование промежуточных аддитивных комплексов в ходе ферментативных ре- [c.60]

Наиболее впечатляющие прямые данные такого рода были получены при изучении взаимодействия некоторых ферментов с их коферментами Ч Например, Велик [24] нашел, что образование комплекса лактатдегидрогеназы с окисленным или восстановленным НАД вызывает существенные изменения в спектре флуоресценции и поляризации флуоресценции компонентов реакции. Данные относительно изменений поляризации флуоресценции особенно убедительны, так как они связаны с молекулярными размерами флуоресцирующей структуры. Изменения поляризации при ассоциации молекулы пиридиннуклеотида с молекулой белка просто поразительны. Эти изменения несомненно связаны с образованием простого аддитивного комплекса, а не промежуточного соединения, являющегося производным фермента, так как анализ кинетических данных [25] показывает, что подобное соединение не участвует в механизме реакции. Тройной комплекс, включающий фермент, кофермент и лактат, образуется до того, как отделится какой-либо продукт реакции (см. гл. VII—IX). [c.61]

С субстратами, наблюдаются непосредственно — с помощью спектральных методов [43], метода электронного парамагнитного резонанса и других методов, позволяющих регистрировать конформационные изменения в белке. При изучении этой литературы, однако, очень важно помнить о принципиальном различии между фермент-субстратным аддитивным комплексом и промежуточным соединением, содержащим замещенную форму фермента. Установить такое различие удается обычно на основании кинетических данных (гл. VHI), но, если такие данные в работе не приводятся, говорить о том, что в ней показано образование комплекса Михаэлиса , как его иногда называют, можно лишь предположительно, пока не будет установлена истинная природа механизма. [c.64]

Очевидно, что для каждой из областей pH в отдельности приведенный выше кинетический анализ полностью аналогичен исследованию неконкурентного действия модификатора. Следует также заметить, что чисто неконкурентное влияние pH, как и чисто неконкурентное ингибирование вообще, наблюдается сравнительно редко, проявляясь лишь в условиях равновесного образования фермент-субстратного комплекса Более того, в условиях, подобных тем, при которых в общем случае проявляется конкурентный эффект модификатора (диссоциация протона только свободного фермента или только свободного субстрата), рН-эффекты будут [c.89]

Уравнения скорости для прямой и обратной реакций имеют классический вид уравнения Михаэлиса. Важно подчеркнуть, что все рассмотренные кинетические схемы не включают стадию образования комплекса Михаэлиса , тем не менее уравнение скорости дается уравнением Михаэлиса. В случае гидрогеназы это отражение того, что при высоких насыщающих концентрациях донора (или акцептора) электрона лимитирующей становится стадия образования фермент-гидридного комплекса. [c.46]

Подавляющее большинство важнейших биологических процессов протекает с участием ферментов, химические свойства которых рассматривают в курсах по биохимии. Ферменты играют ключевую роль в клеточном метаболизме, определяя не только пути превращения веществ, но и скорости образования продуктов реакций. Физические аспекты и механизмы ферментативного катализа подробно рассмотрены в гл. XIV, здесь же будут описаны кинетические свойства ферментативных реакций, которые определяют характер динамического поведения метаболических процессов. Характер ферментативных процессов допускает феноменологическое описание их кинетики с помощью систем дифференциальных уравнений, переменными в которых выступают концентрации взаимодействующих веществ субстратов, продуктов, ферментов. При этом достаточно использовать общие биохимические представления о последовательности событий в ферментативной реакции, не вдаваясь в физические детали механизмов, т. е. учитывать, что необходимым этапом ферментативного катализа является образование фермент-субстратного комплекса (комплекс Михаэлиса), а также использовать представления о регулировании ферментативных процессов ингибиторами и активаторами. [c.61]

Из уравнения (2.21) видно, что термодинамически эффективность ферментативного катализа определяется разницей свободных энергий межмолекулярного (при образовании комплекса Михаэлиса) и внутримолекулярного (в переходном состоянии реакции) образования связи Е-Я. Следовательно, в количественном отношении кинетическая роль комплексообразования Е Н в ускорении ферментативной реакции представляется несколько иной, чем в кинетическом режиме второго порядка (уравнение 2.19). Однако и здесь движущей силой катализа остается свободная энергия взаимодействия Е-Н именно в переходном состоянии реакции (а не в промежуточном комплексе). Действительно, чем более термодинамически выгодным будет внутримолекулярное взаимодействие Е-К в активированном состоянии (чем более отрицательные значения примет величина АОз внутр). тем более благоприятным должно быть отношение VI/ии для ферментативной реакции [см. (2.21)]. Это связано с тем (см. рис. 12), что барьер свободной энергии активации ферментативной реакции (ДО/. внутр) в этом случае уменьшается (по сравнению с ДОи) и, следовательно, скорость процесса [уравнение (2.20)] возрастает. Наоборот, при заданном значении ДО .ппутр термодинамически более благоприятное взаимодействиеЕ -Н в исходном состоянии реакции (фермент-субстратный комплекс ХЕ-КУ) будет тормозить ее протекание. Так, более отрицательные значения Д(3 приводят к неблагоприятным значениям VI /иц в отношении ферментативного процесса [уравнение (2.21)]. Это связано с тем, что активационный барьер Д01% утр (см. рис. 12), определяющий скорость превращения фермент-субстратного комплекса [уравнение (2.20)], при этом возрастает. [c.41]

Прямое кинетическое подтверждение образования промежуточных соединений и Х2 в катализе гидролиза эфиров N-aцилиpoвaнныx-L-аминокислот получено из анализа кинетики реакции на длинах волн поглощения промежуточных соединений ( 290 нм) [9]. Так, при смешивании раствора а-химртрипсина с метиловым эфиром Ы-ацетил-1-фенилаланина наблюдается быстрое (кинетически неразрешенное) спектральное изменение (по-видимому, образование первичного фермент-субстратного комплекса Х ), за которым следует медленная кинетика образования ацилфермента (рис. 64,а). В стационарной фазе реакции в условиях,, когда расходом субстрата можно пренебречь, концентрация ацилфермента сохраняется постоянной последующий расход субстрата приводит к- исчезновению в растворе промежуточных соединений (рис. 64,6) [9]. [c.198]

Исследование ферментативных реакций в предстационарном режиме нуждается в специальной экспериментальной технике, поскольку используемые методы должны иметь достаточно высокую временную разрешающую способность. Мертвое время экспериментальной методики должно быть существенно меньше времени протекания реакции в предстационарном режиме. В качестве примера рассмотрим случай реакции с участием одного промежуточного соединения. Экспериментальную методику можно считать удовлетворительной, если ее мертвое время будет меньше величины т [см. уравнение (5.109)]. Используя наиболее характерные для ферментативного катализа значения констант скоростей, можно оценить величину т. Величина константы скорости образования фермент-субстратного комплекса ( 1) для большинства ферментативных реакций лежит в диапазоне 10 —10 М" X Хс (см. гл. VII). Типичное значение Кт, характерное для многих ферментативных реакций, равно 10 М. Если положить минимальную концентрацию субстрата равной 10" М (эту концентрацию еще можно определить чувствительным спектрофотометрическим методом), зна-чениет будет лежать в диапазоне 10 —10" с. Это показывает, что для исследования предстационарной кинетики ферментативных реакций необходима специальная экспериментальная техника, позволяющая регистрировать кинетические процессы в микро- и миллисекундном временном диапазоне. [c.204]

Однако первая стадия наиболее ответственна, поскольку сама вероятность каталитического акта строго определяется возможностью образования комплекса Михаэлиса. Первично образующееся соединение фермента с субстратом носит название комплекс не вследствие его прямого отношения к классу комплексных соединений, как это понимается в химии, а, скорее, потому, что реальная природа этого соединения пока неизвестна. В огромном большинстве случаев также неизвестны достаточно точно те химические взаимодействия, которые обеспечивают образование комплекса неизвестны и механизмы первичного перераспределения электронов в молекуле субстрата на стадии возникновения первичного комплекса. Более того, до сравнительно недавнего времени мы не имели прямых экспериментальных доказательств реальности существования самих комплексов, которое вытекало в основном из кинетических данных. В 1943 г. были проведены спектральные исследования, свидетельствовавшие о возможности образования промежуточных фермент-субстратных соединений например, в опытах Чанса [13] спектрофотометрическим методом было показано образование комплекса пероксидазы с Н2О2. Были попытки обнаружить фермент-субстратный комплекс методом зонального электрофореза [14]. Однако все эти результаты получены непрямыми методами. В 1963 г. японским авторам Яги и Озава [15] удалось получить прямые доказательства реальности комплекса Михаэлиса. Они выделили стабильный в анаэробных условиях кристаллический комплекс оксидазы D-аминокислот (D-аминокислота О 2 — окси-доредуктаза, КФ 1.4.3.3) с D-аланином (рис. 6). Этот комплекс содержал, помимо апофермента и субстрата, флавинадениндинукле- [c.48]

На основании результатов авторы работы приходят к выводу, что нижние пределы констант скорости образования комплексов фермента с коферментом близки к величинам, полученным независимыми (спектрофотометрическими) методами, что подтверждает ценность кинетического метода. Константы скорости имеют порядок сек и иногда достигают секГ , что не намного ниже верхнего предела, рассчитанного Альберти на основании диффузионной теории Дебая — Смолуховского (10 Л1 сек ). Снижение величины констант связано с влиянием энтропийного фактора. Это влияние в еще большей мере сказывается на последующей реакции комплекса фермент — кофермент с субстратом. [c.76]

Первоначальные попытки объяснить действие ферментов основывались на допущении, что фермент действует на субстрат просто своим присутствием. Например, Барендрехт [4] в 1904 г. высказал предположение, что молекулы субстрата поглощают испускаемое ферментом излучение, вследствие чего активируются и приобретают способность реагировать. Большинство исследователей считают, что для проявления каталитической активности необходимо образование комплекса фермента с субстратом. Исторически представление о соединении фермента и субстрата развилось в связи с попытками объяснить высокую стереохимическую специфичность ферментов по отношению к соответствующим субстратам. Исходя из специфичности ферментов, Фишер [13] предложил в 1894 г. в качестве модели стерических взаимоотношений фермента с субстратом модель ключа и замка однако кинетические предпосылки такой модели впервые отметил лишь в 1902 г. Браун [7]. В соответствии с законом действия масс скорость химической реакции пропорциональна действующим массам реагирующих веществ, причем действующая масса каждого вещества измеряется концентрацией его [c.38]

Кинетические исследования, проведенные Чансом, прямо подтверждают, что тип механизма действия фермента относится к типу, постулированному в разделе 35. Изменения спектра сразу же после начала реакции говорят об образовании комплекса фермент—субстрат, а восстановление первоначального спектра к концу реакции свидетельствует об окончательном выделении [c.741]

Для современных энзимологов существование фермент-субстратных комплексов — почти аксиома. В настоящее время накопилось огромное множество кинетических и других данных, подтверждающих образование таких комплексов в ходе ферментативных реакций, причем многие из них очень трудно объяснить каким-либо иным образом. Наиболее убедительны с этой точки зрения многочисленные прямые наблюдения образования соединений фермента с субстратом. Первое из них — наблюдение осаждения папаина его субстратом фибрином [1] — относится к 1880 году последние известные нам работы такого рода — исследования кристаллического фермент-субстратного комплекса оксидазы О-ами-нокислот с помощью оптических методов и метода ЭПР [2—5]. Классическими примерами служат гемопротеиды— пероксидаза и каталаза [6, 7], для которых образование промежуточных комплексов было доказано с помощью прямых спектроскопических методов более 30 лет назад [8, 9]. Позднее прямые доказательства образования подобных комплексов были получены с помощью самых разнообразных методов при исследовании гидролитических ферментов [10—14], альдолаз [15, 16], ряда дегидрогеназ [17—21] и тиотрансферазы ро-данезы [22, 23]. [c.55]

Чисто ковалентного связывания неизмененного субстрата при образовании фермент-субстратного комплекса, по-видимому, не происходит. Однако известны случаи, когда фермент все же образует ковалентно связанные промежуточные соединения с переносимыми в ходе реакции группировками, принадлежащими субстрату. В некоторых случаях переносимой группировкой является один атом, в других —вся молекула субстрата, за исключением одного атома. Важно, что этот ковалентный тип промежуточного соединения, образующегося путем разрыва связи в молекуле субстрата и образования новой связи между ферментом и фрагментом субстрата, качественно отличен от простого фермент-субстратного аддитивного комплекса. Важные кинетические следствия этого различия мы рассмотрим в гл. VIII. [c.60]

I. Схематическое изображение упорядоченного механизма с образованием тройного комплекса (синонимы —механизм однотактного замещения, механизм дегидрогеназного типа, последовательный механизм) и соответствующие кинетические прямые. Некоторые неустойчивые промежуточные соединения (заключены в скобки) могут быть кинетически незначимыми. //. Общая (неупорядоченная) форма механизма с образованием тройного комплекса, предусматривающая возможность различной последовательности присоединения субстратов к ферменту при образовании комплекса, а также возможность изомернэацаа [c.136]

Эта реакция также легко обратима. При ее исследовании в обоих направлениях установлено, что графики двойных обратных величин пересекаются, как того требует механизм с тройным комплексом, независимо от того, концентрация какого субстрата варьирует. В таких случаях, однако, необходимо дальнейшее уточнение относительных величин различных констант скоростей, поскольку пересечение кинетических прямых характерно также для механизма Теорелла —Чанса, т. е. для случая, когда время жизни тройного комплекса ничтожно мало с кинетической точки зрения, а реальное значение имеет только образование двух двойных комплексов— начальных фермент-субстратных комплексов для двух направлений реакции. Моррисон и Джеймс исключили возможность механизма Теорелла—Чанса для креатинкиназы, опираясь на полученные ими данные об ингибировании прямого й обратного процессов продуктами реакции. Они показали, что кажушиеся ингибиторные константы, характеризующие некоторые реакции конкурентного ингибирования продуктом (нуклеотид — нуклеотид или гуанидинсодержащее соединение — гуанидинсодержащее соединение), зависят от концентрации фиксированного субстрата. Этот результат согласуется с механизмом, при котором все реакции, кроме взаимопревращения двух центральных тройных комплексов, быстро достигают равновесия, но не согласуется с механизмом Теорелла — Чанса. [c.148]

Реакции, для которых йист<Ю л/(моль-с) не лимитируются диффузией и протекают в кинетической области. К ним относятся реакции распада функциональных групп и большинства фермент-субстратных комплексов с образованием продуктов реакции, т. е. стадии (б) процесса деструкции полимеров. В большинстве случа- [c.73]

Несколько лиаз кетокислот, близкородственные альдолазам, также требуют активации добавлением М +, например изоцитрат-лиаза [295], р-окси-р-метилглутарил-КоА-лиаза [296] и цитрат-лиаза [297]. Было высказано предположение, что в катализе лиазами кетокислот [295] участвуют мостиковые комплексы фермент— М + — субстрат, однако имеется мало данных, подтверждающих это предположение. Было показано образование кинетически важного комплекса Мп2+ —цитратлиаза, в котором Мп2+ повышает СРП. Однако не наблюдалось снижение этого эффекта ни при добавлении субстрата (цитрата), ни при добавлении продуктов этой реакции (оксалоацетата, ацетата) [298]. Эти данные, однако, недостаточны, чтобы исключить образование комплекса с металлом в качестве мостика. Сходные результаты были получены при СРП-исследованиях Мп2+-ФДФ-альдолазы из дрожжей, однако в [c.483]

В дальнейшем в связи с повышением чувствительности спектрометров ЭПР стало возможным исследовать этим методом биологические объекты без предварительного высушивания. Были исследованы окислительно-восстановительные ферментативные системы в нативных тканях и их компонентах, модельные ферментативные системы с изолированными ферментами и свободные радикалы, образующиеся при неферментативном ступенчатом окислении биохимических субстратов и активных коферментных групп. При неферментативном окислении биохимических субстратов и коферментов типа флавинмоно-нуклеотида возникает сигнал ЭПР с АЯу г 30 5 и протонной СТС [41]. В то же время при ферментативных окислительно-восстановительных процессах с участием флавиновых ферментов наблюдаются более узкие (АЯ1/. = 13 э) сигналы без СТС. Многочисленными кинетическими экспериментами было показано [42—44], что возникновение сигнала ЭПР обусловлено образованием комплекса фермента с субстратом. Форма и ширина сигнала ЭПР свидетельствуют, однако, что хотя источником неспаренного электрона является низкомолекулярный свободный радикал, адсорбированный на белке—ферменте, плотность неспаренного электрона распределена по значительно большему пространству. Действительно, сигналы ЭПР, наблюдающиеся при ферментативном восстановлении, характеризуются не только исчезновением СТС (что могло бы быть объяснено уширением индивидуальных компонент СТС за счет меньшей подвижности белковых молекул), но и уменьшением суммарной ширины, что может быть понято только при допущении делокализационных или обменных эффектов (см. главу III). [c.214]

В большинстве случаев кинетические измерения хорошо согласуются с теорией Михаэлиса—Ментена (рнс. 9). Однако некоторые из окислений, катализируемых Зр,17р-оксистероид-дегидрогеназой, существенно отклоняются от этой теории (кривая Б на рис. 9). Скорость окисления в этих случаях имеет резкий максимум при критической концентрации и быстро понижается при дальнейшем повыитении концентрации стероида. Эти кинетические данные получают полное объяснение [1, 100], если предположить образование добавочного фермент-субстратного комплекса (ESj), который не может давать продуктов реакции и который содержит две молекулы субстрата на активную часть фермента. Тогда [c.123]

Для объяснения механизма действия ферментов был предложен ряд теорий. В основе всех теорий лежит одна общая идея, а именно идея о том, что соединение с ферментом вызывает определенного рода активацию молекул субстрата вследствие поляризации, смещения электронов или деформации связей, вовлекаемых в реакции. Согласно современной теории, рассматривающей абсолютные скорости реакций, активация происходит путем образования специфичесгого активированного комплекса, что сопровождается изменением как кинетической, так и потенциальной энергии. В ферментативных реакциях активация субстрата происходит путем образования фермент-субстратного комплекса. Образование и превращение фермент-субстратных соединений можно разделить на три стадии присоединение молекулы субстрата к ферменту преобразование первичного промежуточного соединения в один или несколько последовательных активированных комплексов отделение конечных продуктов реакции от фермента. [c.138]

К белковым веществам относятся ферменты, или энзимы, выполняющие в живом организме функцию катализаторов высокой селективности и работающих при очень мягких условиях. Это избирательное действие обусловлено комплиментарностью структур реагирующего субстрата и фермента — тем, что заряд или выступающая группа на поверхности одного из них отвечает противоположному заряду или полости у другого (принцип ключа к замку — см. рис. 48). Вследствие этого молекулы фермента и субстрата настолько сближаются, что резко возрастает эффективность межмолекулярных сил, противостоящих тенденции молекулярно-кинетического движения разъединить взаимодействующие частицы, происходит специфическая адсорбция (образование фермент-субстратного комплекса). Те же силы могут играть существенную роль в самом возникновении структурного соответствия между субстратом и ферментом. [c.245]

Проникновение субстрата с неподходяш ей геометрией требует суш ественно большего раскрытия ш ели, чем в случае геометрического соответствия ш ели и молекулы субстрата. Следовательно, на стадиях образования комплекса фермент-субстрат структурное соответствие может задаваться размером и формой флукту-ируюш ей ш ели. Однако в кинетическом отношении этапы проникновения субстрата в фермент не лимитируют обшую скорость катализа. [c.429]