маркеры в трансформированных клетка

Введение генов непосредственно с помощью Ti-плазмид не используется, поскольку приводит к образованию опухолевых клеток, из которых невозможно получить целое растение. Для этих целей применяют векторные молекулы на основе Ti-плазмид с удаленными онкогенами. Вместо онкогенов в вектор можно встраивать стандартными методами по сайтам рестрикции последовательности клонируемой ДНК [193, 194]. В таких челночных векторных плазмидах сайты рестрикции, по которым производят клонирование, расположены в искусственной Т-области, фланкированной вышеупомянутыми повторами. В качестве селектируемых маркеров в этих плазмидах используют расположенные в Т-области гены устойчивости к антибиотикам или гербицидам, которые позволяют отбирать трансформированные клетки растений. После введения клонируемой последовательности рекомбинантным вектором трансформируют клетки агробактерий и с их помощью при участии vzr-генов осуществляют перенос всей генно-инженерной конструкции в клетки растений. Гены вирулентности могут находиться как в составе самого вектора, так и в ira/15-положении на плазмиде-помощнике. Для получения генетически модифицированных растений суспензию агробактерий можно инкубировать с протопластами, интактными клетками, тканями, листьями или даже целыми растениями. Во всех случаях достигается высокоэффективный перенос рекомбинантной ДНК в геном трансформируемых клеток. Интеграция рекомбинантной ДНК происходит случайным образом с небольшим предпочтением участков активно транскрибируемых генов. [c.140]

А — в условиях роста культуры (маркер Зт относится к акцепторным клеткам, маркер С —к трансформирующей ДНК) [c.356]

Рис. 13-33. Метод, позволяющий идентифицировать и клонировать онкогены человека. Онкогены, содержащиеся в образце ДНК, взятом из опухоли человека, выявляются по их способности трансформировать мышиные клетки ЗТЗ. Трансформированные клетки ЗТЗ безудержно делятся и распознаются по колониям, которые они образуют в культуральной чашке. Новторяюшиеся послеловательности семейства (разд 10.5.11) разбросаны по всем геному человека и служат удобным маркером, который можно использовать для идентификации ДНК человека в клетке другого организма. Используемые в качестве ДНК-зонда последовательности Alu позволяют клонировать онкоген человека, трансформирующий клетки ЗТЗ. Нри повторном тестировании этим же методом клонированная ДНК, содержащая онкоген, будет очень

Предварительно клонированные гены вводят в клетку животных различными путями. Суть одного из них состоит в трансформации клеток требуемым геном, соедршенным с одним из генов, для которых осуществляется селекция. Для идентификации и последующего размножения клеток, содержащих интегрированную ДНК, был разработан метод, получивший название метода маркера. Примером может служить метод получения клеток, дефектных по синтезу фермента тимидинкиназы (ТК -клетки). Такие клетки трансформировались фрагментами ДНК вируса герпеса (HSV), содержащего ген фермента ТК, и после трансформации они приобретали способность к синтезу фермента на селективной среде, т.е. становились ТК -клетками. Клетки ТК легко отличаются от клеток TK , поскольку способны расти на средах с ами-ноптерином (ингибитор, блокирующий определенные стадии биосинтеза нуклеотидов), гипоксантином и тимидином. Следовательно, в данном случае для трансформации клеток животных бьши использовапы гибриды бактериальных плазмвд с геном ТК из вируса герпеса. Для этого предварительно проводили клонирование и идентификацию генов в клетках Е. соИ и затем полученная рекомбинантная плазмида вводилась в ТК -клетки. Анализ мето- [c.125]

Это проверялось в следующем эксперименте. К ДНК, содержащей трансформирующие молекулы с маркером 8ш>, добавлялась ДНК из другого штамма пневмококков, перезистептного к стрептомицину. В пределах линейной части кривой добавка второй неактивной ДНК никак не сказалась, т. е. различные молекулы ДНК сорбировались независимо друг от друга. Однако высота плато понижается при наличии неактивной ДНК, что свидетельствует о конкуренции активных молекул ДНК и разбавляющих инертных молекул за места на клетках. Эта закономерность напоминает изотерму Лэнгмюра для обычной адсорбции в случае, когда число мест на поверхности ограничено. Количество молекул [c.345]

Конечно, все сказанное не означает, что невозможно наблюдать случаи передачи двух несвязанных маркеров с малой вероятностью, paBHoii произведению вероятностей обоих частных событий. Если брать достаточно низкие концентрации трансформирующей ДНК, то количество молекул ДНК, одновременно проникающих в подготовленную клетку, будет мало и вероятность одновременной трансформации но двум маркерам будет стремиться к произведению вероятностей одинарных трансформаций. При пост кповке генетических исследований необходимо тщательно контролировать вынолнение названных условий. [c.347]

Природный процесс имитируют так. Нарезают стебли или листья молодых побегов и наносят на них суспензию агробактерий. Повреждение тканей растения в нарезаемых кусочках (эксплантатах) облегчает перенос Т-ДНК из бактерии — ее рецепторы воспринимают выделяемые в разрезах фенольные соединения как сигнал к атаке . Далее процесс полностью зависит от агробактерии с ее отработанными за тысячелетия навыками генного инженера . Исследователь априори не знает, какая клетка эксплантата трансформируется, сколько копий Т-ДНК встроится в геном и в какие хромосомы, и не в силах это контролировать, но, одновременно модифицируя множество эксплантатов, впоследствии отбирает те регенерировавшие растения, что представляют для него интерес. Собственно, эта работа сродни труду селекционера, который после скрещивания из множества вариантов отбирает нужный. Как в обычной селекции есть маркеры (признаки), по которым ведется отбор, так и в генной инженерии есть набор генов-маркеров, по экспрессии которых определяются факт трансформации, эффективность работы введенных генов в определенных клетках и тка- [c.100]

Трансформация эмбриональных фибробластов крысы двумя онкогенами. При введении двух онкогенов в первичные эмбриональные фибробласты крысы возможен отбор трансформантов по фокусам морфологической трансформации без введения доминантных маркеров устойчивости. Процедура получения морфологических трансформантов при обработке клеток кальцийфосфатным преципитатом ДНК такая же, как описано выше. Смесь двух плазмид, которыми трансформируют первичные эмбриональные фибробласты, растворяют в буфере Б и формируют преципитат, которым обрабатывают клетки. Суммарное количество ДНК на 60 мм чашку, в которой находится 3 10 клеток, не должно превышать 20 мкг. Через сутки клетки рассевают и, меняя каждые 3 сут среду, ожидают появление фокусов морфологической трансформации, которые формируются через 18—21 сут после обработки клеток преципитатом плазмидной ДНК. Затем фокусы выделяют с помощью титановых цилиндров и после размножения клеток определяют гибридизацией по Саузерну присутствие двух онкогенных последовательностей, вводимых в составе различных плазмидных векторов. Выделенные трансформантные клоны можно использовать для изучения различных аспектов канцерогенеза (in vitro и in vivo). [c.230]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология