Белки, денатурация при реокислении

По-видимому, единственный обоснованный метод исследования МВ белка с помощью гелевой хроматографии заключается в определении элюционных характеристик белков, после превращения их в статистические клубки путем разрыва связей 3—3 и денатурации в концентрированных растворах мочевины (8Л/) или гуанидинхлорида (6М). Этот метод основан на результатах Бенуа [42], показавшего, что существует универсальная линейная калибровочная зависимость, связывающая удерживаемый объем макромолекул с логарифмом произведения МВ на характеристическую вязкость [т]]. Однако подобная зависимость не прослеживается у глобулярных белков, возможно вследствие трудности точного определения у них [т]]. С другой стороны, при переходе к денатурированным белкам, когда пептидные цени находятся в конформации статистического клубка, этот метод становится особенно удобным, поскольку, как это установлено в работе [43], для подобных пептидов существует универсальная линейная зависимость 1д [т1]и lg (МВ). Действительно, в работах [44, 45] показано, что имеет место линейная зависимость удерживаемых объемов денатурированных таким образом белков от lg (МВ). Нами была исследована подобная зависимость для ТСГХ денатурированных в мочевине и гуанидинхлориде ДНС-белков [40]. При этом для предотвращения реокисления полученных нри восстановлении меркантоэтанолом ЗН-грунн последние блокировались с помощью иодуксусной кислоты. [c.153]

Наиболее убедительным доказательством того, что первичная структура определяет вторичную и третичную, могут, по-видимому, служить опыты по восстановлению нативной структуры белка после денатурации ренатура-ция белка). Если, например, полностью развернуть молекулу рибонуклеазы путем восстановления четырех ее дисульфидных мостиков меркаптоэта-нолом в 8 Af мочевине, а затем вызвать реокисление таких развернутых молекул в контролируемых условиях, то молекулы (от 95 до 100%) вновь приобретают нативную конформацию, что подтверждается восстановлением не только физических свойств, но и ферментативной активности. Этот опыт схематически представлен на фиг. 42. Статистические расчеты показывают, что если бы реконструкция дисульфидных мостиков происходила совершенно произвольно, то нативную конформацию приобретало бы лишь небольшое число молекул —около 1%. В табл. 20 приведены данные по рена-турации некоторых белков. Во всех случаях, за исключением инсулина, степень восстановления нативных структур значительно превышает величину, которой следует ожидать, исходя из статистических соображений. Эти данные вовсе не означают, однако, что процесс образования дисульфидных связей в белках может протекать in vivo без направленного катализа. Реконструкция нативных белковых структур после восстановительного разрыва дисульфидных мостиков представляет собой слишком медленный процесс, не соответствующий скорости синтеза биологически активных белков [c.113]

Особенно наглядно эти закономерности удалось проследить на примере обратимой денатурации цпстинсодержащих одноцепочечных белков, таких, как рибонуклеаза, химотрипсин пепсиноген Было показано, что полностью восстановленная и ферментативно неактивная рибонуклеаза быка может быть окислена воздухом с восстановлением активности После восстановления и реокисления молекула, по-видимому, имеет ту же самую вторичную и третичную структуры, что и исходный нативный фермент [c.157]

Была исследована способность еще нескольких белков к образованию правильной структуры после восстановления дисульфидных связей. Для всех них кроме инсулина, явно выпадающего из общей картины, были получены сходные результаты. На рис. 1.11 показана структура инсулина она состоит из А-цепи, содержащей 21 остаток, и В-цепи, содержащей 30 остатков. А- и В-цепи соединены между собой двумя дисульфидными мостиками. Кроме того, в А-цепи имеется мостик между полуцистинами 6 и 11. При денатурации инсулина его цепи перепутываются, н гфи реокислении не удается получить достаточного количества нативного белка. Следует иметь в виду, однако, что in vivo инсулин синтезируется как белок-предщественник — проинсулин (см. рис. 1.11). Далее эта молекула подвергается ферментативному расщеплению, фрагмент из остатков с 31-го по 63-й удаляется, и получается функционально активный иноглин. При восстановлении и реокислении проинсулина иммунологическая активность, свойственная нативному белку, восстанавливается. Более того, обрабатывая такой проинсулин трипсином, можно получить биологически активный инсулин. Таким образом, дисульфидные связи самопроизвольно формируются в проинсулине и затем сохраняются в инсулине. Без них инсулин не способен принять нативную конформацию. Возникает естественный вопрос находится ли инсулин в термодинамически наиболее стабильной конформации, по крайней мере в отнощении расположения дисульфидных связей [c.274]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология