Диализ меченого белка

А. Удаление несвязанного радиоактивного иода путем диализа меченого белка [c.414]

В отличие от введения радикалов-зондов приготовление спин-меченых молекул является химической задачей, требующей во многих случаях новых путей ее решения. Однако часто, например при синтезе целого ряда спин-меченых белков, реакция не требует каких-либо дополнительных реагентов, кроме групп, непосредственно участвующих в связывании [см., например, реакцию (1.4)], и осуществляется по простым схемам. Так, например, приготовление спин-меченых белков состоит из двух этапов [И]. На первом этапе водный раствор белка и радикала-метки при определенной величине pH в течение нескольких часов выдерживается при определенной температуре (обычно несколько градусов Цельсия выше нуля для сохранности белка). Затем не связавшийся с белком радикал отмывается от раствора с помощью диализа либо отделяется на хроматографической колонке. [c.121]

Для люминесцентной метки белков применяют флуорохромы изоцианат и изотиоцианат флуоресцеина, некоторые производные родамина, в том числе изоцианат тетраметилродамина, хлорид диметил-нафтил-ами-но-сульфокислоты и ядерный красный прочный. Наиболее широко используется изоцианат флуоресцеина. Его растворяют в смеси диоксана с ацетоном и в таком виде соединяют с белком (обычно глобулиновой фракцией в количестве 5 мг флуорохрома на 100 мг белка) при температуре О—5° С, перемешивая в течение 18 часов. Полученный коньюгат белка с флуоресцеином освобождают от несвязавшегося красителя сначала с помощью диализа против забуференного при рН=9,0 физиологического раствора. Дальнейшая очистка от избыточного красителя производится переосаж-дением белка сульфатом аммония (4—5 раз), пока надосадочная жидкость не перестает люминесцировать. Препараты (мазки, суспензии, замороженные срезы), как фиксированные ацетоном, так и нефиксированные, приводят в соприкосновение с люминесцентно-меченым белком в течение 30 минут, промывают в физиологическом растворе (рН=7ч-7,5) и заключают в забу-ференный глицерин. Исследовать такие препараты лучше при ультрафиолетовом возбуждении. Соответствующие антигены при этом люминесцируют очень ярко светло-зеленым светом. Этот метод позволяет определять внутриклеточную локализацию чужеродных полисахаридов и белков, ферментов и гормонов, устанавливать антигенное родство тканей и клеток, быстро идентифицировать под микроскопом бактерии й вирусы. [c.317]

Матерталы и методы. Бычий сывороточный альбумин фирмы СаШшсЬеш метили по свободной сульфгидрильной группе ма-леимидаой спиновой меткой, как описано в работе [12]. После снин-мечения белок переводили диализом в фосфатный буфер (50 мМ, pH 7,5). Измерения проводили при концентрации белка не выше 10" М. [c.243]

Из развивающихся семядолей гороха и из вегетативных ночек растений гороха был выделен хроматин. Напомним, что семядоли синтезируют глобулин семян гороха, тогда как вегетативные почки не синтезируют этот белок. К каждому из этих двух препаратов хроматина добавляли очищенную РНК-полимеразу и смесь четырех рибонуклеозидтрифосфатов. В такой системе, как это уже отмечалось в гл. 4, хроматин функционирует в качестве матрицы для синтеза информационной РНК. Затем к обеим системам, способным синтезировать информационные РНК, добавляли рибосомную систему синтеза белка, зависящую от информационной РНК. Таким образом, в этой смеси информационная РНК, сиптезироваппая на хроматине, использовалась для функционирования рибосомной системы синтеза белка, причем количества синтезированного растворимого белка были довольно велики. После инкубации рибосомы и хроматин удаляли из системы центрифугированием, а избыток меченой аминокислоты удаляли путем диализа. Долю глобулина в смеси вновь синтезированных растворимых белков определяли с помощью имму-нохимического метода, как это описапо выше для случая синтеза белков в различных органах [c.524]

Фосфорильная группа присоединяется к энзиму необратимо и не удаляется диализом, при денатурации или гидролизе. Получив ДФФ-производное белка и осуществив гидролиз его, можно затем выделить пептид, к которому присоединен ДФФ. Задача облегчается, если берут ДФФ, меченный изотопом фосфора,— тогда из хроматографически разделенной смеси пептидов отбирается пептид, который обладает радиоактивностью. Проведя затем полный гидролиз этого пептида, можно установить аминокислотный состав активного центра фермента. С помощью этого приема, первоначально на химотрипсине, было показано, что ДФФ реагирует с ОН-группой одного из сериновых остатков [c.73]

Однако уже сообщалось [22, 23], что обнаружить иодированные аминокислоты в N-концевом положении тиреоглобулина свиньи, очищенного на ДЭАЭ-целлюлозе, как без метки, так и меченного in vivo с помощью 1 , не удалось. С помощью количественного метода Эдмана [36, 37] из незащищенных N-концевых аминокислот в тиреоглобулине удалось обнаружить только глицин, аспарагиновую кислоту и аспарагин. Эти остатки содержатся в примерном соотношении 2 моля аспарагиновой кислоты (плюс аспарагин) и 1 моль глицина на моль тиреоглобулина [23] ). В ходе этой работы было найдено, что обессоливание белка необходимо проводить с помощью кратковременного диализа или фильтрацией через сефадекс Г-25 при длительном обессоливании в исследуемых экстрактах образуется фенилтиогидантоиновое производное аланина или других аминокислот в количествах, достигающих молярного эквивалента, а в некоторых случаях значительно превышающих его. По-видимому, это объясняется действием следовых примесей протеиназы, активной при нейтральном значении pH. Результаты опытов, которые подтверждают эту точку зрения, представлены в табл. 2. [c.221]

Последующие процедуры лучше всего проводить в холодной комнате. Нерастворимый материал осаждают с помощью настольной центрифуги. Раствор вносят в колонку с L H-сефаро-зой. Скорость потока должна составлять 0,5 мл/мин. После нанесения образца колонку промывают десятикратным объемом (примерно 50 мл) L H-буфера. Если в пробе присутствуют белки, меченные то элюцию материала с колонки можно контролировать на сцинтилляционном счетчике. После промывания колонки с нее снимают адсорбированные гликопротеины с помощью 2%-ного а-метилманнозида и фракции с максимальной активностью объединяют. Полученный материал диализуют 3 ч против буфера для реассоциации (состав буфера см. в разд П1, Г). [c.152]

Вскрыв клетки тем или иным образом и убрав обломки стенок и форменные элементы низкоскоростным центрифугированием, а низкомолекулярные продукты - диализом против подходящего буфера, получаем бесклеточную систему, синтезирующую в небольшом количестве белки из добавленных аминокислот (обычно радиоактивно меченных) Трансляция направляется эндогенной мРНК и продолжается несколько десятков минут. Количество вновь синтезированного белка не бо ее 1-2 % от общего количества белка в системе. Синтезируются большей частью неполные белки, полипептидные обрывки. [c.11]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология