Белки спин-меченые

Для изучения липид-белковых взаимодействий в таких реконструированных системах был применен метод спектроскопии ЭПР [35]. Цитохромоксидаза была очищена и отделена от ассоциированного с нею липида экстракцией растворителем. Путем обратного титрования липидом, содержащим спин-меченный зонд (см. разд. 25.3.5), показано существование слоя липида, прочно связанного с белком (рис. 25.3.9). Кроме того продемонстрировано, что для проявления ферментной активности необходимо существование такого пограничного слоя, состоящего из 50 липидных молекул на молекулу цитохромоксидазы. [c.124]

Впервые спин-меченые белки были получены в 1965 г. [247]. Иминоксильные радикалы можно связать (в зависимости от группы К) с различными группами белков, в частности, с 5Н-группами. В работах [248, 249] метку [c.344]

Полученные результаты показывают реальную возможность измерений величин МРП спин-меченых белков методом ЭПР диапазона 2 мм. В частности, можно надеяться, что использование, помимо величины А , весьма чувствительной к возмущению состояния N—0-фрагмента величины позволит повысить информативность зондирования различных участков белковых молекул с помощью спиновых меток. Измеренные в настоящей работе главные значения -тензора спиновой метки в САЧ могут быть также использованы для точных расчетов формы линии ЭПР в за- [c.191]

СПИНОВЫЙ ОБМЕН СПИН-МЕЧЕНОГО ЛИЗОЦИМА И ГЕМ-СОДЕРЖАЩИХ БЕЛКОВ [c.217]

На рис. 5 представлены результаты экспериментов по спиновому обмену между макромолекулами [7, 8]. Величина Д(1/7 ) для спин-меченого лизоцима линейно зависит от концентрации гем-содержащих белков, как это и предсказывается формулой (10). [c.217]

Анализ спектров ЭПР спин-меченых глобулярных белков показывает, что с помощью модели эквивалентного несферического радикала качественно можно описать наблюдаемые вариации в форме спектров, относящихся к области быстрого вращения радикалов [11]. [c.92]

В отличие от введения радикалов-зондов приготовление спин-меченых молекул является химической задачей, требующей во многих случаях новых путей ее решения. Однако часто, например при синтезе целого ряда спин-меченых белков, реакция не требует каких-либо дополнительных реагентов, кроме групп, непосредственно участвующих в связывании [см., например, реакцию (1.4)], и осуществляется по простым схемам. Так, например, приготовление спин-меченых белков состоит из двух этапов [И]. На первом этапе водный раствор белка и радикала-метки при определенной величине pH в течение нескольких часов выдерживается при определенной температуре (обычно несколько градусов Цельсия выше нуля для сохранности белка). Затем не связавшийся с белком радикал отмывается от раствора с помощью диализа либо отделяется на хроматографической колонке. [c.121]

Способность связывать спиновые зонды может изменяться в зависимости от состояния белка, поэтому степень связывания спиновых зондов можно использовать для изучения конформационных превращений белковых макромолекул. Так, например, с помощью спин-меченых трифосфатов (таких, например, как радикал AXV), обратимо связывающихся с молекулами гемоглобина, удалось исследовать аллостерические взаимодействия в этом белке [191, 194]. [c.192]

Повторяющиеся субъединицы, из которых состоят полимеры небиологического происхождения, значительно более разнообразны по своему строению, чем субъединицы, из которых состоят белковые макромолекулы, рассмотренные в предыдущем разделе. Поэтому синтез подобных спин-меченых макромолекул значительно более уникален, чем синтез спин-меченых белков. Вероятно, по этой причине для исследования полимеров небиологического происхождения значительно чаще используются радикалы-зонды, чем метки. [c.193]

В-третьих, введение в биологические системы стабильных органических молекул, содержащих свободные радикалы (спиновые метки) [71], расширяет возможности использования ЭПР для изучения таких спин-меченых систем. Спиновые метки могут быть присоединены к остатку аминокислоты в активном центре фермента или около него [72], а также могут быть включены в аналог субстрата [73]. В любом из этих случаев может быть оценена степень иммобилизации спиновой метки, связанной с белком, путем сравнения ЭПР-спектров для свободного и связанного состояний, а также может быть изучено действие различных агентов, например диамагнитного иона металла, на окружение спиновой метки [72]. В таких экспериментах спиновая метка действует как детекторная группа [74] и обнаруживается с помощью спектров ЭПР. Однако в присутствии парамагнитных ионов, например Мп2+ к Со +, спин-спиновые взаимодействия преобладают над процессами релаксации и вызывают заметное уменьшение амплитуды ЭПР-сигналов, обусловленных спиновой меткой, поскольку спины ведут себя так, как будто бы они зафиксированы в жесткой решетке [74а]. Этот эффект позволяет рассчитать расстояние между спинами с учетом времени корреляции диполь-дипольного взаимодействия [72, 74а]. Таким образом, использование специфичных спиновых меток для различных аминокислотных остатков или для различных участков активного центра делает возможным создание карты активных центров металлоферментов [746]. [c.452]

Действительно, если контролировать солюбилизацию мембранных фосфолипидов детергентами с помощью высокочувствительных методов, можно убедиться, что повышение концентрации детергента экстрагирует из нативной мембраны все имеющиеся там липиды с одинаковой скоростью, не различая прочно связанные (аннулярные) и свободные липиды (рис. 19). Более того, использование спин-меченых фосфолипидов в процессе реконструкции различных мембранных ферментов позволило измерить скорость обмена молекул фосфолипидов между аннулярным слоем и окружающими липидами. Для разных белков обнаруживается своя доля иммобилизованного липида. По вытеснению метки из аннулярного слоя при добавлении немеченого липида можно определить сродство каждого липида к поверхности белка. Характерно, что значения стехиометрии связывания белком пограничных липидов, измеренные этим методом и рассчитанные из геометрических размеров молекулы белка, практически совпадали. [c.43]

Вычисления, проведенные выше, а также данные табл. 4.7 основаны на двух допущениях, которые могут не подтвердиться. Первое касается возможной гетерогенности распределения присоединенных лигандов в ограниченных участках адсорбента величина т< может быть намного выше, поэтому даже при низких значениях констант связывания (например, 10 М) с адсорбентом может связаться гораздо больше белка, чем можно было бы предположить. В одном из недавних исследований для анализа распределения лигандов использовали модельные спин-меченые лиганды [86]. Оказалось, что негомогенность в их распределении незначительна. Однако было обнаружено (путем подсчета на основе степени модификации), что при близком расположении лигандов друг от друга белок среднего размера может связываться с ними одновременно в нескольких участках (если белок имеет более одного центра связывания). [c.155]

Пример 17-3. Расстояние между местом связывания и аминокислотным остатком белка. Если гистидин-15 лизоцима ковалентно связан со спиновой меткой, содержащей иминоксильный азот, и к ферменту добавляется субстрат — Ы-ацетилглюкозамин (НАГ), резонанс метильных протонов ацетамидной группы НАГ становится шире, чем в отсутствие спиновой метки (рис. 17-18). С помощью простого уравнения по ширине линии можно рассчитать расстояние между неспаренным электроном иминоксильной группы и протонами, ответственными за резонанс. После введения поправки на собственную длину спин-меченого соединения можно вычислить истинное расстояние между протонами суб- [c.512]

Химическая прививка нитроксильпого радикала к макромолекулам с реакционноспособными гругшами, как, напр., при получении спин-меченых полиметилметакрилата и белка [c.399]

В настоящее время известны многие другие примеры реакций нитроксилов, в которых сохраняется структура самого нитро-ксильного радикала. Открытие и исследование реакций, в которых сохраняется радикальный центр, позволили создать принципиально новый метод исследования, получивший название метода спиновых меток (см. 14.4.2). Он широко используется в современной молекулярной биологии и биохимии. Развитие метода спиновых ловушек, стимулированного исследованиями X. Мак-Коннела, идет по двум направлениям. Одно из них связано с синтезом спин-меченых биомолекул — пептвдов, белков, нуклеиновых кислот, сахаров и т.д. Второе направление заключается в синтезе парамагнитных аналогов и моделей биологически акттных соединений, отличающихся от них только наличием радикального центра. Зто дает уникальную возможность установить метаболизм биологически активных соединений. [c.531]

ПО фрагменту N—0, при которец воздействие окружения на величину сводится к перераспределению спиновой плотности между атомами N и О и к изменению расщепления между п-и 1с -уровнями (АЕ ) радикала, а воздействие окружения на величину А, — только к смещению спиновой плотности между атомами N и О. Наличие в спектрах ЭПР некоторых растворов второй компоненты указывает на существование комплексов другого типа. Наиболее интересным является тот факт, что пары для спин-меченого САЧ попадают на общую линейную зависимость. МРП лиофилизованного образца (точка 7 на рис. 7) лежит вблизи соответствующих МРП раствора НО-15 в этаноле, а для водного раствора спин-меченого САЧ (точка 8) — вблизи соответствующих МРП раствора НО-15 в водно-глицериновой смеси. Выполнение линейной корреляции для величин и в САЧ свидетельствует, по-видимому, о том, что структуры микроокружения спиновой метки в лиофилизованном САЧ и замороженных растворах радикалов НО-15 и НО-34 в этиловом спирте идентичны. Это может значить, например, что взаимодействия N—О-фрагмента радикала с ОН-групнами лиофилизованного САЧ в месте локализации спиновой меткими с ОН-групнами этилового спирта близки по характеру. При растворении белка в воде радикальный фрагмент спиновой метки сольватируется молекулами аналогично тому, как он сольватируется в водном растворе. Это указывает на относительную свободу спиновой метки НО-15 в САЧ. [c.191]

Чтобы убедиться в этом, мы синтезировали на ЭВМ спектры ЭПР спиновой метки в 2-лшллиметровом диапазоне в модели САД в соответствии с параметрами, полученными из эксперимента в 3-сантиметровом диапазоне. При этом, так как в этой модели время вращательной корреляции спиновой метки относительно глобулы не определяется, а считается быстрым во временной шкале ЭПР, то мы синтезировали спектры, задаваясь с,=0,1 и 1 НС, считая последнее время границей быстрого движения. Результаты этого синтеза приведены на рис. 9 (а, б) (правые спектры). Слева приведены аналогичные спектры 3-сантиметрового диапазона. Из приведенных спектров видно, что действительно пики, обусловленные и -компонентами тензора, сливаются в один соответствующий и остается группа линий, связанная с и /4, компонентами тензоров. Причем зта характерная особенность в спектрах сохраняется вплоть до границы быстрого движения. Таким образом, модель САД спиновой метки при регистрации спектров ЭПР в 2-миллиметровом диапазоне может быть легко подтверждена или опровергнута. Причем для этого не нужно проводить весь вязкостный эксперимент, а достаточно зарегистрировать спектр спин-меченого белка в воде. На рис. 9, в (справа) приведен спектр ЭПР спин-меченого БСА в воде, зарегистрированный на 2-миллиметровом ЭПР-спектрометре в тех же условиях, что и 3-сантиметровый спектр ЭПР (слева) этого же образца. Видно, что ни о какой аксиальности тензора не может быть и речи, а следовательно, и модель САД спиновой метки в этом случае нельзя считать удовлетворяющей эксперименту. При этом следует отметить, что эксперимент в 2-миллиметровом диапазоне в отношении модели САД спиновой метки является прямым экспериментом по сравнению с 3-сантиметровым диапазоном. [c.249]

Берлинер и др. [8] изучили конформационные изменения трипсина, спин-меченного 1-оксил-2,2,6,6-тетраметил-4-пиперидинилме-тилфторфосфатом, при помощи ЭПР-спектроскопии. Бенко и др. [6] исследовали влияние связывания метгемоиротеииов на частичках латекса на конформационные изменения связанных белков с использованием скоростей продольной магнитной релаксации протонов растворителя. [c.254]

Очень часто наблюдаемый в эксперименте спектр ЭПР нитроксильных радикалов, введенных в систему, является суперпозицией спектров, каждый из которых соответствует своему набору параметров. Подобная ситуация имеет место, наприлшр, когда нитроксильные радикалы локализованы в разных об.иастях гетерогенной или микрогетерогенной системы, а таки е в тех случаях, когда радикалы имеют неско.тько возмож1гых состояний в одном и том же месте системы (последнее сравнительно часто имеет место в случае спин-меченых белков, когда один и тот же радикал-метка имеет на белке несколько возможных адсорбционных состояний, приводящих к слабой и сильной иммобилизации радикала [11, 1231). [c.141]

В работах [78, 91] время корреляции вращения молекулы а-химотрипсина определено с помощью спин-меченого ингибитора, радикала АХП1, который также оказался жестко связанным с молекулой белка (см. раздел И1.4, рис. 1П.12). При 20° С из значения параметра (11.72) получено т = 10,5-10 сек. Теоретический анализ возможных значений времен корреляции, проведенный [c.186]

Серия блестящих работ, опубликованных недавно Мак-Коннеллом с сотр., открыла новый многообещающий аспект применения таких реакций в молекулярной биологии. Пара.магнитные вещества, получаемые в результате реакций радикалов с биополимерами, по предложению хМак-Коннелла получили название сиин-меченых соединений. Спектры ЭПР спин-меченых белков могут дать ценную информацию о молекулярных осях симметрии, об аллостерических структурных изменениях, о природе и порядке связи аминокислотных фрагментов, о фор.ме и хпАП(ческом строении активных центров и их относительном пространственно.м расположении, о над.молекулярной структуре биополимеров. [c.164]

Исходя из того, что одна молекула белка связывала от одного до двух свободных радикалов, авторы предположили, что в сывороточном альбумине имеется две различные аминогруппы, реагирующие с иминоксильными свободными радикалами. В случае присоединения парамагнитной метки к аминогруппе, расположенной на поверхности молекулы белка, получается спектр ЭПР со слабой иммобилизацией спин-метки. Другая аминогруппа, расположенная в глубине белковой глобулы, при связывании со спин-меткой дает спектр ЭПР сильно иммобилизованных свободных радикалов. В последнем случае свободный радикал, связанный ковалентной связью с молекулой белка, гидрофобно взаимодействует с близлежащим участком полипептидиой цепи. При кислотно-щелочной денатурации сывороточного альбумина, а также при переваривании спин-меченого белка пепсином широкие компоненты спектра ЭПР сильно иммобилизованных свободных радикалов исчезали, и сигнал ЭПР исследуемой системы приближался по своим параметрам к спектру ЭПР описанного (стр. 166) спин-меченого поли- -лизина. [c.167]

Исходя из данных по изучению вторичной и третичной структуры белков оптическими и гидродинамическими методами [47], естественно полагать, что состояния спин-меченого фрагмента полипептидной цепи после обработки белка иючевиной и диоксаном отличаются отсутствием или наличием а-спиральной структуры. Наличие вторичной структуры существенно увеличивает жесткость спин-мечеиого участка цепи макромолекулы, а потому подвижность парамагнитной метки в присутствии мочевины значительно больше, чем в присутствии диоксана. [c.169]

Развитие этого метода, стимулированного блестящими работами X. Мак-Кониела, развивается по двум направлениям. Первое связано с получением спин-меченых биомолекул, например пептидов, белков, нуклеиновых кислот, липидов и т. п. [323, 325]. Второе направление — синтез парамагнитных аналогов и моделей физиологически активных соединений [326—330]. Обстоятельный обзор по синтезу спин-меченых соединений дан в [331]. [c.214]

В ТО-е гг. первым исследованием упаковки липидов вблизи мембранного белка в небольпаих временных интервалах (< 10 с) было определение подвижности спин-меченной жирной кислоты в реконструированной системе цитохромоксидаза — эндогенные митохондриальные фосфолипиды методом ЭПР. В дальнейшем подобные эксперименты проводились с использованием цито-хромоксидазы и цитохрома и липидных бислоев, содержаш их грамицидин А, а также мембраны микросом печени крысы, эритроцитов, вирусов Синдбис и везикулярного стоматита. Было показано, что значительная часть липидов в этих мембранах иммобилизована за счет белок-липидных взаимодействий. Количество иммобилизованных липидов при температурах 20—40 °С составляет примерно 0,2 мг на 1 мг белка (47 молекул фосфолипидов на белковый комплекс) цитохромоксидазы, что соответствует приблизительно одному слою липидов вокруг белковой глобулы. Примерно такое же количество (45—90) молекул иммобилизуется за счет взаимодействия с Са -АТФазой саркоплазматического ре-тикулума. Понижение температуры может приводить к возрастанию количества иммобилизованных липидов в 2—3 раза. [c.59]

А а я МОРС 315 8 11 А Все три белка им ют уча тк i вя зывания т нид в La III и Gd III Обнар жено в аим д и м жд этими уча тками и активными ц и рами В V OP 460 и 315 р я не между мета юм и N 0-ipynn и спин меченого гаптена ок ло 10 А а в XRP 25 20 [c.21]

Состояние агрегации иммунных комплексов не должно препятствовать фиксации на Рс-фрагменте компонентов комтемента и, следовательно, их диффузии в преципитате. Изучение структуры специфического преципитата антител с антигенами бьпо проведено с помощью спиновых меток (Григорян и др., 1969). Для мочения белка исполь овали нитроксильный радикал, синтезированный на базе малеинимида. Он ковалентно реагировал с SH-группами кроличьих антител после восстановления 2-мсркаптоэтанолом межцепочечных дисульфидных связей. При этом активность антител сохранялась. В результате преципитации спин-меченых антител яичным альбумином метка продолжала вращаться свободно, не испытывая стерических препятствии. С другой стороны, неспецифическое осаждение спин-меченых антител сульфатом аммония приводило к сильной иммобилизации метки. Эти данные указывают на решетчатую, рыхлую структуру преципитата, образованного иммунными комплексами. [c.32]

Куликов А. В. Определение расстояния между спинами метки и парамагнитного центра в спин-меченых белках по параметрам кривых насыщения спектра ЭПР метки при 77° К-— Мол. биол., 1976, 10, с. 132—141. [c.37]

Кяйвяряйнен А. И. Раздельное определение собственных времен корреляции спин-меченых белков и связанных с ни ми меток.— Мол. биол., 19756, 9, с. 805— 811. [c.37]

Метод спиновых меток оказался весьма эффективным для изучения структуры биологических мембран и конформационных явлений в мембранах [263, 264]. Весьма перспективно изучение ядерной релаксации в биополимерах, содержащих парамагнитную метку. Время релаксации зависит от взаимодействия спинов ядра и электрона и, следовательно, от расстояния между ними (Т пропорционально г ). Тем самым, можно получить информацию о геометрии молекулы и о ее движениях [265]. В работах [266] изучались спектры ЭПР и ЯМР алкогольдегидроге-назы, меченной аналогом никотинамидадениндинуклеотида. Оказалось, что метка конкурирует с НАД-Н в месте связывания ферментом, сильно иммобилизуется белком, резко изменяет время релаксации протонов воды, причем величина Т сильно зависит от концентрации спирта. Установлено место связывания спирта этим ферментом и оценены кинетические и геометрические характеристики системы. [c.346]

Как было показано Описи, Бойенсом и Мак-Коннеллом 157), изучение. юнокристаллов белков, меченных иминоксильными радикалами,. может дать уникальную информацию о структуре исследуемых молекул. Основные результаты были получены авторами на оксигемоглобине лошади с применением малеимидных спин-меток. [c.174]

Чтобы сравнить конформацию в порошках при очень низких степенях гидратации (0,02) с конформациями при более высоких уровнях гидратации (выше 0,2), были сняты спектры ЭПР образцов лизоцима, ковалентно меченных сукциними-дил-2,2,5,5-тетраметил-3-пирролин-1-оксил-3-карбоксилатом. Материал содержал две спиновые метки на одну молекулу белка для того, чтобы спин-спиновое взаимодействие было достаточно сильным. Спектры снимали при —160°С при различных степенях гидратации. При этой температуре молекулярное движение не дает вклада в наблюдаемый спектр, и анализ формы линий можно использовать для оценки расстояния между спиновыми центрами [31]. Форма линий не зависит от степени гидратации (табл. 6.4). Среднее расстояние между спиновыми центрами составляет 26—28 А. Поэтому вплоть до разрешения в 1 А никаких изменений конформации с изменением степени гидратации не обнаруживается. Это заключение справедливо исключительно для тех участков белковой молекулы, которые прореагировали со спиновой меткой, и сохраняется возможность изменений на расстоянии более 1 А в других частях молекулы. Однако авторы полагают, что такая возможность маловероятна из-за широкого распределения аминогрупп около поверхности молекулы лизоцима и вследствие кооперативной природы процесса изменения конформации. Теоретически возможно также, хотя и мало вероятно, что конформации, различающиеся при различных уровнях гидратации при 25 °С, сводились бы к одной и той же при —160°С. Поэтому факт неза- [c.131]

Для изучения интенсивности белкового обмена в органах центральной нервной системы, влияния на него голодания и авитаминоза А. В. Палладии и П. Вертаймер [1521] изучили скорость включения в белки 5 из меченого метионина, вводимого под кожу подопытным животным. У кошек через 24 часа наибольшее количество 5 находилось в сером веществе больших полушарий головного мозга и в мозжечке, а наименьшее — в спинном мозге. [c.498]

При изучении белков нервной ткани интересные данные получены в результате применения изотопного метода. Установлено, что введенные в организм меченые аминокислоты (З -метионин, С -глицин и другие) появляются в составе белков paзJЦIчныx отделов нервной системы. Особенно интенсивно включаются аминокислоты в белки головного и спинного мозга в случаях субокципитального их введения и при введении их в спинномозговую жидкость, т. е. в обход так называемых барьеров, препятствующих проникновению тех или иных веществ в нервную ткань. [c.559]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология