Галактозидаза пептид

Работы по генно-инженерному получению инсулина начались около 20 лет назад. В 1978 г. появилось сообщение о получении штамма кишечной палочки, продуцирующего крысиный проинсулин (США). В этом же году были синтезированы отдельные цепи человеческого инсулина посредством экспрессии их синтетических генов в клетках Е. соИ (рис. 5.11). Каждый из полученных синтетических генов подстраивался к 3 -концу гена фермента -галактозидазы и вводился в векторную плазмиду (pBR322). Клетки Е. соИ, трансформированные такими рекомбинантными плазмидами, производили гибридные (химерные) белки, состоящие из фрагмента -галактозидазы и А или В пептида инсулина, присоединенного к ней через остаток метионина. При обработке химерного белка бромцианом пептид освобождается. Однако замыкание дисульфидных мостиков между образованными цепями инсулина происходило с трудом. [c.133]

То, что сворачивание полипептида в белок происходит в процессе синтеза на рибосоме, т. е. ко-трансляционно, следует из целого ряда косвенных свидетельств. Одно из них— приобретение растущим пептидом на рибосоме активностей, присущих готовому белку со сформированной третичной структурой. Давно известный пример — синтез Р -галактозидазы ферментативная активность этого белка требует не только сворачивания полипептидной цепи в третичную структуру, но и объединения четырех субъединиц в четвертичную структуру оказалось, что растущая цепь до своего завершения, будучи присоединенной к рибосоме, уже способна ассоциировать со свободными субъединицами белка, и комплекс на рибосоме проявляет Р-галактозидазную активность. [c.273]

Еще более убедительны опыты, демонстрирующие приобретение растущим пептидом на рибосоме иммунологической специфичности, присущей нативной конформации готового белка. Так, рибосомы, несущие растущие цепи р-галактозидазы, реагируют с антителами против готового фермента еще задолго до завершения трансляции мРНК и освобождения белка. Используемые антитела были специфичны к третичной структуре денатурация рибосомосвязанного материала путем нагревания полностью разрушала его способность реагировать с антителами. [c.273]

Очевидно, что растущий пептид должен выходить из рибосомы где-то на стороне, контактирующей с мембраной. Прямые иммуно-электронно-микроскопические попытки выявить место выхода синтезируемого белка ( -галактозидазы на 70S рибосомах Е. oli [c.276]

Клетки Е. oli выращивались на среде, содержащ изотоп серы или углерода С . В некоторый момент клетки переносились на обычную питательную среду без изотопной метки и одповременно с помощью индуктора запускался синтез фермента Р-галактозидазы. Фермент выделялся в чистом виде из суммарного клеточного белка, затем измерялся его изотопной состав. Оказалось, что Р-галактозидаза содержит только нерадиоактивную серу или углерод, т. е. целиком синтезирована из веществ с изотопным составом той среды, на которой клетки жили в данный момент. В то же время все прочие белки клеток построены из аминокислот, меченных радиоактивными изотопами. Если бы распад и ресинтез белков действительно имел место, Р-галакто-зидаза должна была бы синтезироваться с исиользованием радиоактивных иредшественников — пептидов или аминокислот. Ничего подобного не наблюдалось. Синтезированные белки в живых клетках абсолютно не расщеплялись и оставались неизменными, пе вступая в обмен со средой. [c.447]

Проблема внутриклеточной стабильности рекомбинантных белков больше связана с деградацией небольших пептидов, поскольку крупные нативные белки более стабильны в бактериальных клетках. Один из подходов, позволяющих стабилизировать короткие чужеродные пептиды в клетках Е. соН, - включение требуемого пептида в состав гибридного белка. В этом случае последовательность нуклеотидов, кодирующую гибридный белок, соединяют в составе экспрессирующего вектора в одной рамке считывания с бактериальным геном, кодирующим белок (например, геном -галактозидазы). Образующийся в результате экспрессии такого рекомбинантного гена гибридный белок в своем составе содержит в N- или С-концевой части требуемый пептид, защищенный основным белком-носителем от протеолитической деградации. Для отделения пептида от белка-носителя их соединяют друг с другом последовательностью аминокислот, по которой можно провести специфическое расщепление полипептидной цепи. В том случае, если пептиды не содержат метионина, соединение белка-носителя и пептида осуществляют через эту аминокислоту, и отщепление пептида производят с помощью бромистого циана. Такой подход был использован, например для получения рекомбинантного соматостатина, а также А- и В-цепей инсулина. [c.117]

Через два года группа американских ученых осуществила синтез второго искусственного гена пептидного гормона — соматостатина (рис. 1.41). Кодоны, соответствующие каждой аминокислоте, были выбраны исходя из первичной структуры пептида не произвольным образом, а с учетом частоты их встречаемости в геноме фага М82. Синтезированный дуплекс содержал на 5 -конце кодирующей цепи триплет метионина (для направленного расщепления полипептида в этой точке после трансляции) и имел последовательности, соответствующие липким концам, образуемым рестриктазами ЕсоШ и ВатШ. Ген соматостатина был введен в специально сконструированную плазмиду в участок гена б-галактозидазы. Таким об- [c.62]

Первые плазмидные векторы такого типа созданы в 1984 г. на основе плазмиды pBR322 и последовательности ДНК, которая содержит тандемно расположенные промоторы генов липопротеина и -галактозидазы Е. соИ, состыкованные с геном сигнального пептида белка ОтрА Е. соИ (основной белок наружной мембраны клеточной стенки). Причем полученные векторы pIN-III-ow/ A-l, pIN-III-ow/ A-2 и pIN-Ш-отрА.-Ъ обеспечивают разные рамки трансляции встроенных в них кодирующих последовательностей. Встройка в pIN-III-owj A структурного гена зрелой формы у8-лактамазы привела к секреции у8-лактамазы в периплазму клеток [c.132]

Первые эксперименты такого типа были выполнены в 1978 г. независимо двумя группами исследователей, которым удалось в клетках Е. соЫ выявить синтез химерного белка, сохранившего иммунохимические свойства белка овальбумина к)ф. Продукция овальбуминопо-добного белка достигала 1-1,5 % суммарного белка клетки. Данный белок содержал последовательность сигнального пептида пре-овальбу-мина, и этот гетерологичный сигнальный пептид, имеющий на N-конце несколько аминокислот /3-галактозидазы, оказался способным выполнять функции, необходимые для секреции белка овальбумина в периплазматическое пространство клеток Е. соИ. В ходе секреции молекулы химерного белка процессировались, давая начало зрелой форме овальбумина. [c.161]

Б. Юхарк с соавторами сконструировали гибридный ген, в котором к последовательности, кодирующей HB Ag, подстроили в правильной рамке трансляции ген-эквивалент протективной антигенной детерминанты вируса ящура, представляющей собой последовательность 142-160 АК вирусного белка VP1. Детерминируемый гибридным геном химерный белок оказался токсичным для Е. соИ, поэтому он был синтезирован в культуре клеток животных V-1. Химерный белок формировал вирусоподобные частицы, которые после очистки от других белков проверяли на иммуногенность. Показано, что по иммуногенным свойствам полученные надмолекулярные структуры, в которых многократно представлены встроенные эпитопы, приближаются к частицам вируса ящура (табл. 17.1). В то же время химерный белок /3-галактозидаза — протективный эпитоп белка VP1 вируса ящ)фа /3-Gal/(137-162 АК)г, а тем более синтетические пептиды обладали значительно меньшей иммуногенной активностью по сравнению с частицами, формируемыми химерой HB Ag/142-160 АК. [c.436]

Смотреть страницы где упоминается термин Галактозидаза пептид: [c.203] [c.248] [c.262] [c.113] [c.232] [c.267] [c.165] [c.483] [c.67] [c.73] [c.165] [c.198] [c.233] [c.72] [c.113] [c.133] [c.154] [c.163] [c.225] [c.426] [c.222] [c.223]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология