Гибридные гены, экспрессия

Экспрессия любого эукариотического гена с целью получения нативного белка требует использования структурной части гена в сочетании с соответствующими нуклеотидными последовательностями, которые распознаются ферментами клетки-хозяина как эффективные сигналы инициации транскрипции, трансляции, терминации трансляции и, возможно, терминации транскрипции. Сконструированный нужным образом гибридный ген, содержащий регуляторную область бактериального происхождения и структурную область гена человеческого интерферона, встраивают в плазмиды, способные автономно реплицироваться и стабильно поддерживаться в процессе роста микроорганизмов (рис. 38). [c.193]

Э. Экспрессия гибридных генов и очистка синтезируемых продуктов [c.149]

Б. Элементы, участвующие в регуляции транскрипции при экспрессии гена, обычно расположены в области 5 -концов генов. Таким образом, если экспрессия этих генов контролируется на уровне инициации транскрипции, что, вероятно, и имеет место в данном случае, то вполне можно ожидать, что гибридные гены, как и нормальные, должны экспрессироваться в соответствии с тем, какая последовательность расположена на их 5 -концах. Следовательно, гибридные гены у дихроматов, не воспринимающих красного цвета (С К ), и аномальных по красному цвету трихроматов (С К ), вероятно, экспрессируются, как гены красного пигмента, так как их 5 -концы относятся к генам красного пигмента. Аналогичным образом у дихроматов, не воспринимающих зеленого цвета (О К" ), и у аномальных по зеленому цвету трихроматов (О К ) гибридные гены экспрессируются как ген зеленого пигмента, поскольку содержат 5 -концы. [c.430]

Чтобы снизить вероятность получения ошибочных результатов, мы советуем исследовать лизат, содержащий гибридные белки, с помощью вестерн-блот-анализа с использованием антител к -галактозидазе (рис. 5.3) —это позволяет детектировать все минорные продукты. Кроме того, все получаемые результаты необходимо сопоставить с анализом нуклеотидной последовательности клонированный ДНК. Для идентификации продуктов клонированных генов можно также использовать вторые антитела, специфичные к антигенным детерминантам, которыми предположительно должен обладать гибридный белок. Поскольку уровень экспрессии гибридных белков высок, мы рекомендуем использовать иммуноферментный метод выявления антигенов с помощью вестерн-блот-анализа (табл. 5.2) ввиду надежности и быстроты этого метода. [c.149]

При конструировании гибридных генов кодирующую последовательность можно помещать под контроль тандемно повторенных промоторов. Это, как правило, приводит к увеличению эффективности транскрипции изучаемого гена. Собирая блоки из двух-трех различных промоторов с разной системой репрессии-индукции, можно гибко регулировать экспрессию целевого гена и обеспечивать сверхсинтез кодируемого им белка. [c.267]

Ряд гибридных клеточных клонов (человек - мышь) исследовали для определения в них экспрессии определенных человеческих генов и присутствия тех или иных хромосом человека. Результаты приведены в таблице. Определите хромосомную локализацию каждого искомого гена. [c.332]

Первый этап-это слияние соматических клеток человека и мыши. После нескольких клеточных делений образуются клоны, сохранившие лишь одну или несколько человеческих хромосом. Следующим этапом является установление связи между экспрессией данного гена и присутствием определенной хромосомы (или участка хромосомы) в гибридных клонах. [c.291]

Работы по генно-инженерному получению инсулина начались около 20 лет назад. В 1978 г. появилось сообщение о получении штамма кишечной палочки, продуцирующего крысиный проинсулин (США). В этом же году были синтезированы отдельные цепи человеческого инсулина посредством экспрессии их синтетических генов в клетках Е. соИ (рис. 5.11). Каждый из полученных синтетических генов подстраивался к 3 -концу гена фермента -галактозидазы и вводился в векторную плазмиду (pBR322). Клетки Е. соИ, трансформированные такими рекомбинантными плазмидами, производили гибридные (химерные) белки, состоящие из фрагмента -галактозидазы и А или В пептида инсулина, присоединенного к ней через остаток метионина. При обработке химерного белка бромцианом пептид освобождается. Однако замыкание дисульфидных мостиков между образованными цепями инсулина происходило с трудом. [c.133]

В этой главе описываются две широко распространенные векторные системы, используемые для экспрессии клонированных генов с образованием гибридных белков, включающих - [c.138]

Основным преимуществом бацилл с точки зрения создания молекулярных векторов является их способность секретировать из клеток в культуральную среду большие количества определенных белков. Это связано с тем, что клеточная стенка у грамположительных бактерий организована более просто, чем у грамотрицательных. Исходя из общности механизмов секреции белков через плазматическую мембрану в клетках различных типов, чрезвычайно заманчиво конструировать методами генетической инженерии гибридные гены, в которых чужеродная кодирующая последовательность состыкована с ген-эквивалентом сигнального пептида какого-либо секретируемого белка Ba illus. Если детерминируемый таким искусственным геном химерный продукт будет способен секретироваться в культуральную среду, то это значительно упростит очистку изучаемого белка. Возможно, в таком случае чужеродный белок в бактерии будет синтезироваться интенсивнее, чем в варианте без секреции, так как он в меньшей степени будет нарушать метаболизм клеток. Данное направление исследований — изучение механизма секреции, создание векторов экспрессии-секреции — в генетической ин-, женерии бацилл имеет большое практическое [c.233]

Прежде всего, это необходимость правильного фолдинга исследуемого полипептида в составе гибридной молекулы, что особенно проблематично в том случае, когда белок имеет небактериальное происхождение. Кроме того, рекомбинантный белок, будучи экспонированным на поверхности фаговых частиц, должен обладать достаточной стабильностью. Эти и многие другие проблемы, связанные с недостаточной эффективностью экспрессии гибридных генов в системе фагового дисплея, должны решаться с использованием общих подходов к оптимизации экспрессии рекомбинантных генов в бактериальных системах, рассмотренных в первой части книги. С помощью подходящих бактериальных штаммов и условий культивирования можно решать многие из этих проблем. Тем не менее, при отборе ферментов с требуемыми свойствами чаще всего приходится пользоваться оригинальными подходами, к счастью опирающимися в своей основе на общие принципы, которые будут кратко перечислены ниже. [c.345]

Генно-инженерные опыты продемонстрировали, что синтезируемые в Е. oli чужеродные прокариотические и эукариотические пре-бел-ки, содержащие сигнальные пептиды, способны правильно процессироваться и секретиро-ваться в периплазматическое пространство клеток. Более того, в ряде работ показано, что гибридные гены, состоящие из генов сигнальных пептидов Е. oli и изучаемых структурных генов, обусловливают в Е. соИ синтез химерных белков и их секрецию. Эти данные указывают на значительную универсальность организации сигнальных пептидов и в связи с этим — на перспективность создания специализированных векторов экспрессии-секреции для клеток Е. соИ. [c.132]

Таким образом, суть разработанной стратегии заключается в том, что искусственный ген встраивается внутрь структурного гена, кодирующего определенный бактериальный белок. Иншщация синтеза РНК и белка происходит на регуляторных участках бактериального оперона, а терминация трансляции — на нонсенс-кодонах синтетического гена. Экспрессия такого гибридного гена приводит к появлению химерного белка, содержащего аминокислотную последовательность бактериального белка и пептида, кодируемого синтетическим фрагментом ДНК. Необходимо, чтобы встраиваемая нуклеотидная последовательность кодировала пептид без сдвига рамки трансляции по отношению к бактериальному гену. Целевой пептид при этом можно выщеплять из состава химерного белка специфичным химическим или ферментативным гидролизом. [c.165]

В лаборатории Б, Ройзмана в 1983 г. в составе бактериальной плазмиды состыковали промотор гена а4 HSV-1 и кодирующую последовательность хромосомного гена овальбумина курицы. Экспрессия гибридного гена была подвержена ташй же регуляции, как и экспрессия вирусного гена 4. На следующем этапе (1984 г.) в той же лаборатории в ген тимидинкиназы вируса простого герпеса рекомбинационно встроили ген-эквивалент поверхностного антигена S вируса гепатита В, объединенный с промотором либо гена а4, либо гена tk HSV-1. Отобранные по фенотипу TK гибридные варианты HSV-1 направляли эффективный синтез HBsAg, который секретировался из клеток и формировал специфичные частицы диаметром около 22 нм. Причем в зависимости от использованного промотора гибридный ген S экспрессировался или как ранний ген, или как ген -типа. [c.386]

В другом эксперименте в результате инъекции в ооцит гибридного гена, состоящего из кодирующей последовательности гена tk вируса герпеса и промоторно-регуляторной области гена металлотиоиеина 1 мыши, получена трансгенная мышь, в печени и почках которой вирус-специфический фермент продуцировался на высоком уровне. Экспрессия гена МТ-1 метал-лотионеина контролируется на транскрипционном уровне ионами тяжелых металлов и глюко-кортикоидными гормонами. Показано, что гибридный ген, состоящий из регуляторной области МТ-1 и структурной части гена tk, в ооцитах мыши подвержен регуляции ионами кадмия, как и нативный ген МТ-1. После инкубации ооцитов с ионами кадмия выявляемая в них активность тимидинкиназы вируса герпеса увеличивалась примерно в 10 раз. [c.451]

Последовательность оснований длиной 6 — 8 нуклеотидов, расположенная непосредственно перед инициирующим кодоном АУГ у Е. соИ, определяет эффективность процесса трансляции. Эта последовательность представляет собой участок связывания мРНК с рибосомой, и его сдвиг в ту или иную сторону способен уменьшать эффективность трансляции мРНК. По имени исследователей, идентифицировавших этот участок, он был назван последовательностью Шайн-Дальгарно. Обычно эту последовательность включают в состав самого вектора вместе с инициирующим кодоном на нужном расстоянии. При экспрессии векторов такого типа образуется гибридный белок, в котором несколько N-концевых аминокислотных остатков происходят от источника регуляторных элементов и инициирующего кодона прокариотического гена. Такие гибридные белки часто более стабильны обработка их химическим или ферментативным способом приводит к вьщелению эукариотической части белка. [c.123]

Бактерии, синтезирующие эндонуклеазы рестрикции, защищают собственную ДНК от расщепления с помощью ферментов, метилирующих те участки молекулы, с которыми связывается соответствующая эндонуклеаза рестрикции. Однако геном клетки-хозяина не защищен от рекомбинантной рестриктазы Fokl, и чтобы предотвратить гибель растущих клеток, синтез гибридного фермента подавляли, поместив ее ген под контроль системы экспрессии бактериофага Т7. [c.174]

Другая система предоставляет возможность для выделения дискретных точек начала репликации. Клетки дрожжей S. erevisiae, мутантные по какой-то функции, могут быть трансформированы путем добавления ДНК, которая несет копию гена дикого типа. Схема эксперимента представлена на рис. 31.13. Мутация клетки-хозяина должна затрагивать ген, продукт которого можно селектировать. ДНК клеток дикого типа выделяют, фрагментируют и клонируют в составе плазмид Е. oli. Гибридные плазмиды инкубируют с мутантными клетками дрожжей в таких условиях, в которых эти клетки способны выжить только в случае экспрессии гена дикого типа. В зависимости от частоты возникновения трансформированных клеток различают два типа трансформации. [c.403]

Альтернативные методы скрининга космидных библиотек, описанные в гл. 3, предполагают селекцию космидных клонов с использованием феномена гомологичной рекомбинации in vivo. Остальные главы книги посвящены вопросам, связанным с экспрессией клонированных генов. Для многих белков млекопитающих удалось осуществить высокопродуктивную внутриклеточную экспрессию в Е. oli. Однако гетерологические белки, локализующиеся в цитоплазме, часто образуют трудно растворимые агрегаты, что значительно осложняет получение нативного продукта. В гл. 4 описаны эффективные способы выделения активных растворимых продуктов из нерастворимых белков цитоплазмы Е. соИ. Вероятность деградации специфическими бактериальными протеиназами многих эукариотических белков, синтезируемых в Е. oli, может быть существенно снижена, если их экспрессировать в виде гибридных белков. Такие составные белки, в которых бактериальный компонент обычно представлен -галактозидазой, можно использовать в качестве иммуногенов для получения антисыворотки и моноклональных антител к клонированному эукариотическому белковому домену. Эти вопросы >ассматриваются в двух главах — одна посвящена получению поликлональной антисыворотки, а другая — методам гибридной технологии. В последующих главах книги описаны современные эукариотические экспрессирующие системы в гл. 7 — дрожжевая, далее в трех главах — системы на основе культивируемых клеток млекопитающих и трансгенные животные. В частности, описана система экспрессии с использованием векторов, которые несут гены, обеспечивающие возможность их индуцибельной амплификации это позволяет снимать токсическое действие антибиотиков, введенных в культуральную среду. Клонированные в таком векторе гены также [c.8]

Имеются два общих подхода к осуществлению внутриклеточной экспрессии клонированных генов. Соответствующий ген может быть клонирован в одной рамке считывания с синтетическими или бактериальными кодирующими последовательностями и экспрессироваться с образованием гибридного белка. Другой способ — непосредственная экспрессия встроенного гена. Потребность в экспрессии эукариотических полипептидов в составе гибридных белков возникла, когда было обнаружено, что уровень экспрессии эукариотических белков в клетках Е. oli ограничивается по той причине, что они распознаются клеткой как чужеродные и разрушаются [9]. Это особенно наглядно проявилось в случае полипептидов небольшого размера. При сшивании эукариотического гена с бактериальным синтезировались гибридные продукты, которые накапливались в клетке в значительно больших количествах [10, 11]. Однако, если требуется получить эукариотический полипептид в чистом виде, возникает необходимость в методе, позволяющем правильно расщепить гибридный белок. С другой стороны, непосредственная экспрессия одного эукариотического гена дает возможность получить нужный белковый продукт. Однако первичные продукты трансляции несут на своем Ы-конце остаток метионина. В клетках Е. соН имеются ферменты, осуществляющие при необходимости эффективное отщепление метионина от природных белков однако в случае рекомбинантных белков эти ферменты работают не столь эффективно [1]. Таким образом, белки, полученные в результате прямой экспрессии эукариотического гена, могут содержать несвойственный природному белку N-концевой метионин. [c.98]

Возможность экспрессии клонированных эукариотических генов в клетках Е. соИ способствовала углубленному изучению множества белков, представляющих интерес для фундаментальных научных исследований и медицины. В тех случаях, когда нативный негибридный белок экспрессируется недостаточно эффективно, часто экспрессия белков или их фрагментов в виде гибридов с полипептидами Е.соИ, такими, как -галактозидаза, оказывалась более успешной. К тому же гибридные белки можно легко очищать с помощью хроматографических методов, разработанных для -галактозидазы. Эукариотические белки, экспрессируемые в составе гибридных продуктов, были с успехом использованы при изучении иммунологически важных участков поверхностных антигенов [1], функций рекомбинантных полипептидов [2], при получении иммунологических зондов, необходимых для исследования ранее не изученных антигенов [3—6], для экспрессии вариантных форм белковых субъединиц и для выделения и исследования клонов ДНК из экспрессирующихся библиотек генов [8—10]. Технология работы с экспрессирующими векторами достигла столь высокого уровня развития, что стало возможным осуществлять в клетках Е. соН достаточно эффективную экспрессию практически любой кодирующей последовательности с образованием гибридного продукта, который можно выделить с помощью разнообразных биохимических методов и использовать его либо в различных функциональных исследованиях либо в качестве иммуногена. Синтез чужеродного полипептида в виде гибридного белка с -галактозидазой, по всей вероятности, значительно увеличивает стабильность этого полипептида в клетках Е. соИ. По-видимому, стабильность белка, а не сила промотора — наиболее важный фактор для успешной экспрессии рекомбинантных белков в бактериях. [c.138]

Размер гетерологичного белкового фрагмента — важный параметр при клонировании гибридных белков, содержащих -галактозидазу. Стабильность (а следовательно, и выход) гибридных белков, как правило, снижается при увеличении размера чужеродного фрагмента. Во многих случаях желательно, чтобы в состав гибридных белков входили короткие фрагменты. Для получения специфических антител вполне достаточными оказываются фрагменты гетерологичной ДНК, кодирующей антиген длиной всего 200 п.н. [16]. Вместе с тем использование коротких фрагментов может привести к тому, что при небольшой относительной массе чужеродного полипептида (по сравнению с массой -галактозидазы) титр специфичных к чужеродному белку антител у иммунизированных животных окажется низким. Аффинная очистка антител в этом случае также менее эффективна вследствие низкой емкости аффинных колонок, в которых связанные с носителем гибридные белки несут короткие гетерологичные фрагменты. Один из путей решения этой проблемы состоит в увеличении молярного соотношения гетерологичный фрагмент -галактозидаза в гибридном белке. Это достигается пришиванием к гену la Z множественных тандемных копий гетерологичного фрагмента ДНК. На рис. 5.5 приведены сравнительные результаты клонирования и экспрессии одной из пяти копий кодирующего фрагмента гена ftz Drosophila в pUR291. Выход гибридного белка, кодируемого одной копией этого гена, примерно в десять раз превышает выход белка, кодируемого пятью тандемными копиями. [c.147]

Наличие большого числа копий экспрессирующего вектора в сочетании с индуцибельной экспрессией гена la Z обеспечивает синтез большого количества гибридного белка. С учетом большой молекулярной массы данных белков это делает несложным их выявление при гель-электрофорезе. Было установлено, что в 1 мл индуцированной под действием ИПТГ ночной [c.176]

Смотреть страницы где упоминается термин Гибридные гены, экспрессия: [c.437] [c.195] [c.329] [c.334] [c.367] [c.44] [c.161] [c.163] [c.321] [c.326] [c.351] [c.420] [c.102] [c.134] [c.102] [c.151] [c.137] [c.302] [c.107] [c.107] [c.139] [c.151] [c.173] [c.174] [c.183] [c.202] [c.204]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология