ДНК химерные молекулы

Известно три основных типа ферментов рестрикции. Рестрицирующие эндонуклеазы (рестриктазы) первого типа узнают определенную последовательность нуклеотидов и разрезают двухцепочечную молекулу ДНК неподалеку от этой последовательности, но само место разреза не строго специфично. Эндонуклеазы рестрикции второго типа узнают определенную последовательность и разрезают двойную спираль в определенной фиксированной точке внутри этой последовательности. Эндонуклеазы рестрикции третьего типа узнают нужную последовательность и разрезают двойную спираль, отступив определенное число нуклеотидных пар от ее конца. Мы в основном сосредоточимся на обсуждении свойств эндонуклеаз второго типа, поскольку именно они позволяют, во-первых, получать препараты ДНК, содержащие фрагменты с одинаковыми последовательностями нуклеотидов и, во-вторых, конструировать химерные молекулы ДНК, состоящие из фрагментов, взятых из разных геномов. [c.267]

Векторные плазмиды и векторные вирусы со встроенными чужеродными генами часто называют гибридными (шти химерными) плазмидами (или фагами). После конструирования рекомбинантных ДНК их с помощью трансформации вводят в реципиентный организм бактериальную, грибную, растительную или животную клетку. Трансформация предусматривает предварительную обработку клеток соединениями, обусловливающими проникновение ДНК внутрь клеток с последующим их помещением в среду, в которой способны существовать только клетки, получившие векторную молекулу, например в среду с определенным антибиотиком. [c.120]

Но одно дело — создать химерную молекулу ДНК в пробирке, а совсем другое дело сделать так, чтобы она была биологически активна, чтобы могла размножаться в составе живой клетки да еще менять генетические свойства клетки. В этом и состоит основная проблема генной инженерии. Сразу же подчеркнем, что проблема эта еще далека от своего окончательного решения. Более того, в ходе работы возникли совершенно новые трудности, о которых даже не подозревали, когда работа начиналась. Однако наряду с многочисленными трудностями природа приготовила для генных инженеров замечательный подарок в виде совершенно особых организмов, плазмид. Все достигнутые до сих пор успехи генной инженерии связаны с плазмидами [c.59]

Конструирование химерных молекул, о которых шла речь выше, — это первый этап в создании моноклональных антител мышей и крыс, обладающих сходством с антителами человека. Другой подход состоит в замещении только DR-участков человеческих антител фрагмента- [c.216]

Если один из двух фрагментов ДНК, используемых при конструировании химерной молекулы, представляет собой самостоятельный репликон, например, плазмиду или эписому, то химерная молекула при попадании в бактериальную клетку-хозяина также может обладать способностью к репликации. Репликация такого репликона будет приводить к размножению также второго фрагмента, составляющего рекомбинантную молекулу. Исходный репликон становится при этом вектором для другого фрагмента ДНК. [c.276]

Конструирование химерных молекул ДНК [c.39]

Химерная молекула. Молекула (ДНК, РНК, белок), состоящая из фрагментов, которые имеют разное происхождение. [c.52]

Генетические и в особенности генно-инженерные методы позволяют соединить участок ДНК, несущий регуляторную область и сигнальную последовательность одного белка, с участком ДНК, кодирующими аминокислотную последовательность другого белка. В результате в клетке синтезируется гибридный или химерный белок. Такого рода эксперименты показали, что различные сигнальные последовательности эукариот и прокариот обычно взаимозаменяемы и обеспечивают выведение из цитоплазмы экспортируемых белков. Однако если второй белок в норме является цитоплазматическим, то экспорт его чаще всего не происходит. Иногда это связано с тем, что такие белки содержат внутренние участки, которые напоминают стоп-трансферные последовательности и поэтому застревают в мембране. Кроме того, у прокариот, где экспорт не сопряжен строго с трансляцией, может иметь значение неспособность образующихся химерных молекул принять конформацию, необходимую для последующей их транслокации из цитоплазмы. [c.67]

В рекомбинантных ДНК, поддерживаемых в таких системах, часто возникают внутренние делеции некоторых, например, повторяющихся последовательностей. Кроме того, при введении рекомбинантных ДНК в клетки дрожжей иногда имеет место проникновение в одну клетку нескольких молекул вектора со вставками. В итоге отдельные клоны дрожжевых клеток могут содержать несколько несцепленных друг с другом молекул рекомбинантных ДНК, а рекомбинация между ними вообще может приводить к образованию химерных молекул, которые являются одной из главных проблем, возникающих при использовании YA 40-60% клонов могут содержать химерные молекулы. Все это очень затрудняет физическое картирование генов в хромосомах исследуемых объектов. [c.92]

Получение ферментов с новыми свойствами путем объединения гомологичных белковых доменов. Случайное объединение участков полипептидных цепей двух близкородственных ферментов, методическое обеспечение которого рассматривалось выше, находит широкое применение в направленной эволюции белков. Однако такой подход порождает большое количество химерных молекул, полностью утративших биологическую активность, так как в ходе подобных манипуляций с большой вероятностью происходит нарушение тонких внутримолекулярных взаимодействий, обеспечивавших функциональность исходных белков. [c.378]

В рассматривавшихся до сих пор реакциях углеродный скелет вступающего в реакцию соединения в общем оставался неизменным функциональные группы также сохраняли свое положение в молекуле. Существует, однако, много реакций, сопровождаемых перемещением функциональных групп илн изменениями углеродного скелета такие реакции называют перегруппировками. Для них создаются благоприятные условия в тех случаях, когда перемещаемые группировки благодаря эффектам соседних групп (ан-химерным эффектам) оказывают пространственное или электронное влияние на ход реакции. [c.264]

Многие органические молекулы устойчивы в жидком состоянии и распадаются на радикалы только в газовой фазе. Часто их распад протекает цепным путем (см. гл. 12). В жидкой фазе с заметной скоростью распадается ограниченный круг соединений. К ним относятся соединения с достаточно слабыми О—О, С—N и 5—8-связями. Подробно изучен распад таких соединений, как пероксиды и азосоединения, которые широко используют в технологии и исследовательской работе в качестве инициаторов цепных жидкофазных реакций. На примере этих соединений обнаружены и изучены следующие три механизма распада молекул распад с разрывом одной связи, согласованный распад с разрывом нескольких связей и распад с химерным взаимодействием. [c.244]

Применение химерных белков В некоторых случаях конечным продуктом, который предполагается использовать, является сам химерный белок. Например, нередко возникает необходимость в получении антител, узнающих конкретный участок белковой молекулы. Чтобы рещить эту задачу, можно встроить в подходящий вектор сегмент ДНК, кодирующий белковый домен, к которому будут вырабатываться нужные антитела. Образующийся в результате химерный белок и будет служить антигеном. Антитела к стабилизирующему его белковому компоненту, происходящему от хозяйской клетки, можно удалить абсорбцией их на чистом стабилизирующем белке, и тогда останутся только антитела, связывающиеся с нужной аминокислотной последовательностью. [c.113]

Рис. 10.16. ВИЧ-инфекция и ее терапия. А. Связывание ВИЧ с Тд-клеткой опосредуется контактированием вирусного белка gpl20 с Т -клеточным поверхностным белком D4. Б. На поверхности ВИЧ-инфицированной клетки находится белок gpl20, с которым может связываться свободный химерный комплекс D4—токсин. Попав внутрь инфицированной клетки, токсиновая часть химерной молекулы убивает ее.

После выделения рестриказ из разных форм бактерий исследователи получили возможность разрезать ДНК на какие угодно куски (каждая рестриказа гидролизует свои связи в молекуле ДНК), а затем с помощью других ферментов — лигаз сшивать куски в каком угодно порядке, и все это в пробирке . Конечно, это еще не было решением проблемы — так можно было создать только химерную молекулу ДНК, но ведь нужно было, чтобы она была биологически активной, могла размножаться в живой клетке да еще и менять ее генетические свойства. [c.562]

Ферменты рестрикции позволяют вырезать любые произвольные фрагменты ДНК и комбинировать из них in vitro рекомбинантные (или химерные) молекулы. Это оказывается возможно, поскольку многие рестриктазы разрезают двойную спираль так, что место разреза одной цепи сдвинуто относительно второй, в результате чего образовавшиеся фрагменты обладают комплементарными одноцепочечными концами (см. табл. 9.1). Эти концы могут соединяться посредством образования водородных связей между комплементарными основаниями, причем сшиваться таким образом могут различные фрагменты ДНК, как это показано на [c.275]

Такой поиск осуществляют следующим образом. Библиотеку фагов X высевают на большую чашку Петри, так чтобы на чашке было приблизительно 10000 негативных колоний. Например, библиотека генома Drosophila melanogaster умещается всего на четырех таких чашках. Каждая негативная колония содержит химерные инфекционные фаги и большое количество химерных молекул фаговой ДНК, не уместившихся в головки фагов. Эта свободная ДНК дает возможность определить, какие именно из негативных колоний содержат интересующие нас [c.281]

Современные ВАС-векторы позволяют клонировать фрагменты ДНК длиной до 300 т.п.о. и выше. Рекомбинантные молекулы вводятся в клетки Е. соИ с помощью электропорации (см. раздел 3.8), причем эффективность образования трансформантов в 10-100 раз выше, чем при обычной трансформации сферопластов дрожжей векторами семейства YA . Это позволяет уменьшить исходное количество ДНК, необходимое для конструирования репрезентативных клонотек генов (см. гл. 4). При скрининге таких клонотек используются традиционные методы работы с бактериальными колониями. В отличие от Y АС-ДНК, которая находится в клетках дрожжей в линейной форме, ВАС-векторы со вставками, как и традиционные F -факторы, существуют в бактериальных клетках в виде кольцевых суперскрученных молекул. Это облегчает их выделение и последующую работу с рекомбинантными молекулами ДНК в растворе, а кроме того, допускает повторное введение в бактериальные клетки этих ДНК, выделенных мини-препаративными методами. Поскольку рекомбинантные ВАС-векторы существуют в бактериальных клетках в виде одной копии, исключаются совместное клонирование в одной клетке разных фрагментов ДНК и образование химерных молекул, что очень важно для физического картирования больших геномов методами снизу вверх . Весьма существенным свойством системы клонирования, основанной на векторах семейства ВАС, является ее генетическая стабильность. Исходная структура клонированных фрагментов ДНК в пределах точности использованных методов сохраняется в таких векторах даже после 100 серийных пересевов бактериальных клеток, содержащих рекомбинантные молекулы ДНК. Все вышеперечисленные свойства переводят векторы ВАС в разряд сверхъемких векторов нового поколения. [c.94]

Данную проблему решили в 1993 г. X. Хама-мото с соавторами, которые предложили использовать природную стратегию синтеза двух полипептидов РНК-полимеразы вируса табачной мозаики. Авторы создали векторную конструкцию, в которой после стоп-кодона гена СР ввели последовательность из шести нуклеотидов, обеспечивающую прочтение этого кодона как значащего. Далее в совпадающей рамке трансляции встроили последовательность, кодирующую пептид длиной 12 АК — ингибитор фермента, конвертирующего ангиотензин-1. При введении гибридной РНК TMV в клетки растений наблюдался синтез как немодифици-рованного СР, так и его химерной формы. После сборки вирусные частицы содержали в своем составе около 5 % химерных молекул СР (см. рис. 19.10, б). Продуктивность в листьях табака или томатов в пересчете на химерный белок при этом достигала 100 мкг/г сырого веса. [c.477]

Проводятся исследования но созданию т. наз. химерных Т. бактерий (их получают методами генетич. инженерии), к-рыс содержат в молекуле домены разных токсинов. Таким образом можно получать Т., ранее не существовавшие в природе (напр.. Т., содержащие домены токсинов бактерий и фитотоксиноа). [c.602]

Расщепление химерных белков В зависимости от предназначения белкового продукта клонированного гена он может использоваться как таковой или в составе химерного белка, причем последний вариант встречается нечасто. Например, из-за присутствия фрагмента хозяйского белка большинство химерных белков оказываются непригодными для применения в клинике, а сам продукт клонированного гена-мишени может оказаться неактивным. Кроме того, для химерных белков предусмотрена более сложная процедура тестирования, которую они должны пройти, чтобы получить разрешение к применению у соответствующих организаций. Все это заставляет искать способы удаления лишних аминокислотных последовательностей из молекулы получаемого продукта. Один из таких способов основан на присоединении белка, кодируемого геном-мишенью, к белку клетки-хозяина, содержащему короткий пептид, распознаваемый специфической протеазой небактериального происхождения. Такое присоединение тоже программируется на уровне ДНК. Олигонуклеотидные линкеры, несущие сайты для протеаз, можно пришить к клонированному гену до того, как такая конструкция будет введена в экспрессирующую векторную систему слияния. Линкером может служить, например, олигонуктеотид, кодирующий пептид Пе-01и-01у-Аг . После синтеза и очистки химерного белка для отделения белкового продукта, кодируемого клонированным геном, можно использовать фактор свертывания крови Х , который является специфической протеиназой, разрывающей пептидные связи исключительно на С-конце последовательности Ile-Glu-Gly-Arg (рис. 6.6). Более того, поскольку такой пептид [c.112]

Рис. 6.10. Химерные белки, состоящие из поверхностного бактериального белка и чужеродного белка-мишени, присоединенного к его N- или С-концу (А) либо включенного в экспонируемые участки молекулы (5). В обоих случаях чужеродные нентиды или белок оказываются на поверхности бактериальной клетки.

Еще одна проблема - невысокая стабильность белков, кодируемых клонированными генами. Рекомбинантный белок может расщепляться про-теиназами хозяйской клетки. Чтобы избежать этого, можно изменить клонированный ген таким образом, чтобы на N-конце белковой молекулы оказались одна или несколько дополнительных аминокислот. В такой форме рекомбинантный белок уже не подвергается столь быстрой деградации. Кроме того, лишние аминокислоты иногда помогают в последующей очистке химерного белка, например с помощью иммуноаффинной хроматографии на колонке. При этом место соединения компонент подбирается так, чтобы по нему можно было расщепить молекулу (химическим или ферментативным путем) и получить эти компоненты в чистом виде. [c.130]

Смотреть страницы где упоминается термин ДНК химерные молекулы: [c.125] [c.509] [c.125] [c.41] [c.162] [c.165] [c.41] [c.96] [c.162] [c.165] [c.410] [c.383] [c.51] [c.217] [c.217] [c.114] [c.116] [c.174] [c.208] [c.221] [c.222] [c.231] [c.232] [c.243]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология