ПЦР-амплификация генома плазмиды

Амплификация - увеличение числа копий генов, плазмид, фрагментов ДНК. [c.61]

На первом этапе создания штамма-проду-цента в составе единого фрагмента ДНК в плазмиде pBR322 был клонирован весь i/гг-оперон. Полученная за счет этого амплификация генов треонинового оперона привела к возрастанию в клетке уровня активности соответствующих ферментов и, как следствие, к увеличению биосинтеза треонина. Более того, бактерии, содержавшие гибридную плазмиду, приобретали способность выделять треонин в культуральную среду. Полученный штамм Е. соИ накапливал треонин в относительно большом количестве — 1-2 г/л питательной среды, однако это не является сверхпродукцией. [c.167]

Генетическая инженерия — важнейший прогрессивный способ изменения генетической программы организма в целях создания высокопродуктивных штаммов промьпштенных микроорганизмов. Успехи современной генетической инженерии сушественно влияют на промышленную биотехнологию. Яркий пример больших возможностей генетической инженерии — создание во ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов штамма Е. oli для получения треонина. В результате были изменены не только регуляторные свойства фермента аспартаткиназы, но и питательные потребности штамма. Введение в геном бактерии нового гена обеспечило бактерии возможность использования в качестве источника углерода сахарозу, основного дисахарида традиционного промышленного сырья — свекловичной мелассы. Перечисленные манипуляции наряду с амплификацией плазмид, содержащих оперон треонина, позволили значительно увеличить производительность штамма бактерии и получить за 40 ч ферментации 100 г L-треонина на 1 л культуральной жидкости. Учитывая исключительные способности штамма Е. соН к сверхсинтезу L-треонина, японская фирма Адзиномото приобрела в 1982 г. лицензию на использование российского штамма — продуцента треонина для организации собственного производства. [c.50]

Незначительные ограничения этого метода компенсируются информацией, которая может быть получена из независимых анализов комплиментарных цепей. Применение ферментов в этом методе ограничивается введением метки в концевой фосфат и рестрикционным расщеплением цепей на блоки подходящей длины, примерно в 100—150 остатков, с частичным их перекрыванием. Метод нашел наибольшее применение в определении последовательности оснований контролирующих областей генов, например для исследования дуплекса в 223 пары оснований, представляющего собой ген 5S РНК пекарских дрожжей и имеющего промоторный и тер-минаторньй участки транскрипции [24]. Другой прекрасный пример использования этого метода — установление полной первичной структуры -глобиновой мРНК кролика, структура которой была закреплена получением с помощью транскриптазы соответствующей ей циклической ДНК [25]. В ходе амплификации этой циклической ДНК клонированием бактериальных плазмид (см. разд. 22.3.4) были потеряны 13 остатков с 5 -конца. К счастью, их последовательность удалось установить в результате исследований с использованием метода плюс и минус [26]. Совместное применение этих методов позволило установить последовательность гена длиной в 589 пар нуклеотидов. [c.192]

Частично вырожденные олигонуклеотиды могут быть встроены в ген-мишень разными способами. Один из подходов состоит в следующем. Ген встраивают в плазмиду между двумя унжальными сайтами рестрикции и проводят амплификацию его [c.165]

Плазмиды — дополнительный внехромосомный генетический материал. Представляет собой кольцевую, двунитевую молекулу ДНК, гены которой кодируют дополнительные свойства, придавая селективные преимущества клеткам. Плазмиды способны к автономной репликации, т. е. независимо от хромосомы или под слабым ее контролем. За счет автономной репликахщи плазмиды могут давать явление амплификации одна и та же плазмида может находиться в нескольких копиях, тем самым усиливая проявление данного признака. [c.20]

Все рассмотренные выше методы селекции продуцентов биологически активных веществ сегодня, в период интенсивного развития методов генной инженерии, называют традиционными методами. Эти методы в прошедшие 30 лет в огромной мере содействовали созданию микробиологической промышленности антибиотиков, аминокислот, ферментов, витаминов и других практически важных веществ. Исчерпали ли традиционные методы свои возможности Нам кажется, думать так преждевременно, как и надеяться на то, что генная инженерия в ближайшее время сможет быть применена для создания и улучшения обширного круга принадлежащих к разным таксономическим группам продуцентов, которыми располагает сейчас микробиологическая промышленность. Даже более реальная возможность использовать иа основе генноинженерных методов в качестве продуцентов микроорганизмы, для которых эти методы наиболее отработаны, например E sheri hia oli, едва ли удовлетворит промышленность числом продуктов микробного синтеза. В связи с этим очень важно для старых перспективных в промышленном отношении микроорганизмов, помимо совершенствования методов отбора нужного типа мутантов, развивать методы генетического обмена на основе слияния протопластов, трансдукции, трансформации хромосомной и плазмидной ДНК, которые расширяют возможности традиционных методов селекции. Вместе с тем у промышленных микроорганизмов все шире проводится поиск плазмид и предпринимаются попытки их использования в качестве векторов при переносе генетического материала, его клонировании и амплификации. Эти исследования важны для понимания генетического контроля сложных процессов синтеза, таких, иапример, как синтез антибиотиков, для выявления узких мест в биосинтезе многих других продуктов. Одновременно они приближают промышленные микроорганизмы к объектам генной инженерии. Методология генной инженерии постоянно совершенствуется и расширяет свои возможности. В таком успешном встречном развитии разных методов и их слиянии на все большем числе продуцентов можно представить себе ближайшее будущее селекции микроорганизмов, призванной обеспечить промышленность высокопродуктивными штаммами. [c.95]

Интересная особенность строения генома актиномицетов — явление амплификации части генома. Амплифицированные последовательности (АП) имеют размер от 50 т. п. о. до примерно 0,2 т. п. о. и от 10 до 500 тандемно повторяющихся копий. В сумме они могут составлять до 30 % генома. По крайней мере в некоторых случаях повторяющаяся единица фланкирована прямыми повторами. Возможно, повторы имеют функции IS-элементов. Рекомбинация по прямым повторам может приводить к вариантам, имеющим отличную от исходной локализацию генов, расположенных между ними, вариантам с разным числом копий этих генов и полностью утратившим эти гены. Все это приводит к возникновению мутантных фенотипов. Возможно, это вторая причина помимо интеграции и вырезания плазмид, приводящая к реверсибильной и нереверсибильной генетической нестабильности у актиномицетов. [c.169]

Изучение механизма регуляции репликации фактора R1 привело Дж. Ларсена с соавторами (1984 г) к созданию нового типа векторных плазмид серии pOU. Поскольку интенсивность репликации плазмиды R1 находится в прямой зависимости от уровня синтеза белкового продукта плазмидного гена герА, авторы сконструировали гибридные плазмиды, у которых в непосредственной близости от гена герА встроен фрагмент ДНК фага Я, содержащий ген l857 и промотор pR, направленный в сторону гена герА. При температуре ниже 35 °С в клетке находится примерно 1 молекула плазмиды серии рОи. При температуре 42 °С в результате инактивации термочувствительного репрессора с1857 происходит дерепрессия промотора pr, приводящая к конститутивной неконтролируемой репликации плазмиды. Уже через 1-2 ч после термоиндукции плазмидная ДНК составляет половину всей ДНК клетки (более 1 ООО копий на клетку). Параллельно с амплификацией плазмиды происходит и сверхсинтез кодируемых ею белков. [c.140]

Смотреть страницы где упоминается термин ПЦР-амплификация генома плазмиды: [c.108] [c.186] [c.140] [c.169] [c.258] [c.258] [c.343] [c.108] [c.176] [c.150] [c.187] [c.80] [c.274] [c.87] [c.93] [c.219] [c.258] [c.260] [c.290] [c.291] [c.296] [c.8]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология