Нозерн-гибридизация

В этом разделе рассматриваются основные методы использования РНК-зондов при исследовании нуклеиновых кислот в обычной лабораторной практике. В раздел включены детальные описания методов, в которых РНК используются вместо ДНК-зондов при Саузерн- и нозерн- гибридизации и в опытах по защите от действия РНКазы. [c.27]

Таблица 1.5. Нозерн -гибридизация

Метод Нозерн -гибридизации по существу идентичен гибридизации по Саузерну и детально описан в табл. 1.5. [c.29]

Метод также можно применять и для РНК. Для переноса РНК с агарозы в среду, пригодную для проведения гибридизации, его необходимо несколько видоизменить. Такой метод известен под названием Нозерн-блоттинга . [c.243]

Нозерн-блоттинг. Метод переноса РНК из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр, на котором положение определенной молекулы РНК выявляют с помощью гибридизации с радиоактивным зондом. Обратная транскрипция. РНК-зависимый синтез ДНК, катализируемый обратной транскриптазой. Палиндром. Участок двухцепочечной ДНК, в которой последовательность одной из цепей идентична последовательности другой цепи, прочитанной в обратном направлении. [c.51]

В случае Нозерн -гибридизации РНК-зонды оказались гораздо более чувствительными, чем ДНК-зонды. Мелтон и др. [5] сообщали о достигнутом ими 10-кратном повышении чувствительности метода при использовании РНК-зондов как выяснилось, это общее правило. РНК-РНК-гибриды более стабильны в растворах формамида, чем аналогичные ДНК-ДНК-гибриды, что и порождает проблему неспецифичности гибридизации. В частности, связывание некоторых зондов, обладающих способностью к перекрестной гибридизации с рибосомной РНК, стало серьезной проблемой, и для выявления специфических гибридов приходится варьировать степень жесткости отмывки. В общем случае лучше с осторожностью относиться к полосам РНК, по размеру совпадающим с 28- или 185-РНК, до тех пор, пока не будут получены еще и другие доказательства того, что они появились в результате специфической гибридизации. Для удаления неспецифических гибридов некоторые исследователи предлагают проводить отмывку в присутствии РНКазы. В этом случае фильтры нельзя использовать повторно. [c.30]

Нозерн-блоттинг (Nothem blotting) Перенос молекул РНК, подвергнутых элктроферезу, с геля на твердую подложку (нитроцеллюлозный или найлоновый фильтр) с последующей ДНК—РНК-гибридизацией. [c.554]

Рис. 26.7. При анализе ядерной РНК с помощью блоттинга по Нозерну и гибридизации с зондом, содержащим овомукоидные последовательности, обнаруживается ряд дискретных предшественников мРНК.

Что происходит с удаленными интронными участками Эксперименты по гибридизации с популяцией ядерных РНК свидетельствуют о том, что концентрация овальбуминовых интронных последовательностей примерно в 10 раз ниже, чем концентрация последовательностей экзонов. Возможно, это означает, что удаленные из молекул интроны довольно быстро разрушаются, а предшественники, идентифицируемые при Нозерн-блоттинге или при электронно-микроскопическом анализе, представляют собой популяцию более стабильных ядерных молекул. Все промежуточные продукты, которые подвергаются более быстрому процессингу, будут присутствовать в относительно небольших количествах, так что обнаруживаемые предшественники-это промежуточные продукты, процессинг которых происходит медленно и которые поэтому присутствуют в более высоких концентрациях. [c.324]

Рис. 4-72. Методы Нозерн - и Саузерн -блоттинга. После электрофоретического фракционирования смеси молекул ДНК или РНК в агарозном геле проводят перенос различных фрагментов нуклеиновых кислот на лист нитроцеллюлозы или найлона ( блоттинг ). Этот лист затем инкубируют с радиоактивным ДНК-зондом в течение длительного времени в условиях, способствующих гибридизации. Затем лист тщательно промывают, гак что радиоактивно меченными оказываются лищь те фрагменты, которые гибридизуются с ДНК-зондом. На радиоавтографе,

Обычно для изучения транскрипции перенесенных генов выделяют РНК, и содержание в препаратах специфических транскриптов определяют путем гибридизации с соответствующими меченными пробами (клонированными кДНК или ядерными генами) методом дот-блоттинг-гибридизации (разд. 6.3). Метод нозерн-блоттинга (приложение 6[1]) можно использовать для получения более подробной информации о размерах определенного транскрипта. [c.238]

Использование основных приемов работы с рекомбинантной ДНК и методик анализа белков и нуклеиновых кислот позволяет клонировать гены и изучать их организацию (блоттинг-гибридизация по Саузерну), строение мРНК (нозерн-блоттинг),. а также следить за уровнем экспрессии генов в различных условиях окружающей среды и даже в процессе развития. Например, в некоторых случаях уровни транскрипции гена определяют методом дот-блот-гибридизации выделенной РНК (разд., 6.3). Более подробные качественные исследования транскрипционной активности осуществляют с помощью нозерн-блоттинга (приложение 6 [I]). 5 - и З -концы транскриптов определяют, используя Sl-картирование [2, 56]. Однако такие методы анализа позволяют установить только строение транскрибируемой области или гена, а также механизмы процессинга транскриптов и их трансляции. Функцию любых участков вне транскрибируемой последовательности в некоторой степени можно изучать, сравнивая гены, обладающие сходными механизмами регуляции. При этом большинство предположений о воздействии на экспрессию гена остаются исключительно в области догадок. В этом случае генетическая трансформация предоставляет исследователю, работающему с растениями, уникальную-возможность непосредственно отвечать на фундаментальные вопросы, касающиеся регуляторной функции последовательностей, расположенных как в непосредственной близости, так и на некотором расстоянии от 5 - и З -концов транскрибируемого-гена. Используя разнообразные методы мутагенеза in vitro и технологию рекомбинантных ДНК, удается, модифгщировать клонированные гены и затем после введения мутантного гена-путем генетической трансформации обратно в растения анализировать влияние изменения этого гена на его экспрессию.. Подобные методики способствовали изучению нуклеотидных [c.307]

В приведенном ниже эксперименте изучали регулируемую фитохромом транскрипцию собственных генов ab у этиолированного растения гороха. РНК из гороха, выращенного в разных режимах освещения, выделяли, как описано в разд. 4.7. Цель эксперимента — определение в каждом образце уровня транскрипции мРНК с генов ab методом количественного точечного нозерн-блоттинга. В качестве пробы для гибридизации использовали клоны кДНК гена ab. [c.328]

Какие из перечисленных ниже пpoбJIeм невозможно решить с использованием методики Нозерн-блот-гибридизации [c.22]

Блоттинг. Почти во всех случаях, подобных описанным выще, ДНК перед гибридизацией переносят с геля на более подходящую подложку. Этот метод (блоггшг) широко используется, например, для идентификации специфических РНК и белков после их электрофоретического разделения (см. разд. 7.7 и 6.4 соответственно). Блоттинг ДНК назван по имени его изобретателя блоттингом по Саузерну (или саузерн-блоттингом) соответствующие методики для РНК и белков получили название нозерн-блоттинга и вестерн-блоттинга. [c.278]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология