Методика анализа белковых гидролизатов

Гордон, Мартин и Синдж [249—251] разработали метод применительно к рядовой методике анализа белков и нашли возможным определять в гидролизате 25 мг белка фенилаланин (лейцин, изолейцин), валин, аланин, пролин, тирозин, метионин и триптофан. При проявлении применялись 4 жидкости хлороформ, содержащий 1 % и 17% н-бутилового спирта, и циклогексан, содержащий 5 и 30% -пропилового спирта. [c.78]

В настоящее время метод газо-хроматографического разделения и анализа аминокислот не представляет еще законченного и универсального способа аминокислотного анализа белковых гидролизатов. Разработанные методики конверсии аминокислот в летучие производные, особенно количественной конверсии в К-ТФА-метиловые, и в значительной степени их успешное разделение на колонках с низким содержанием полиэфирных полярных стационарных фаз позволяют уже сейчас в ряде случаев использовать метод газо-жидкостной хроматографии для определения абсолютных количеств аминокислот в смесях. Но требуется дальнейшая доработка метода, и в особенности его аппаратурного оформления, прежде чем он займет должное место при изучении аминокислотного состава белков. [c.267]

На современной стадии развития анализа весьма желательно, чтобы анализ белковых гидролизатов в каждом случае контролировался повторением всей методики анализа на искусственной смеси аминокислот, возможно ближе повторяющей состав гидролизата. Затем, если необходимо, может быть сделано последующее приближение. Применение таких смесей в значительной мере предохраняет от неудовлетворительных результатов, которые часто получают при простом приложении к гидролизату одного белка такой методики анализа, которая может дать удовлетворительные результаты с гидролизатом белка другого состава. Часто принимается, что определение 100% аминокислоты, добавленной к гидролизату, доказывает точность метода. Эта экстраполяция, однако, нё всегда оправдана. [c.62]

В пятидесятых годах, в период бурного развития БХ, был опубликован ряд статей с описанием методик и систем растворителей, предназначенных для разделения белковых гидролизатов или аминокислот, полученных из различных физиологических жидкостей (см. [51, 77]). Эти системы использовались для разделения сложных смесей аминокислот и пептидов и смесей аминокислот, с трудом поддающихся идентификации, например лейцин, изолейцин. С появлением автоматических аминокислотных анализаторов [120], а также новых ионообменников (см. гл. 5) БХ все реже и реже используют для анализа аминокислот и пептидов. В настоящее время в лабораториях, ведущих исследование белков, методом БХ проводят главным образом окончательную очистку простых смесей пептидов, полученных с помощью других методов разделения, кроме того, БХ служит одним из критериев однородности вещества (часто в сочетании с электрофорезом на бумаге), и только в считанных случаях ее применяют для идентификации отдельных аминокислот. [c.121]

Хроматографические методы были впервые использованы Муром и Стейном [2] для анализа белкового гидролизата в 1951 г. По методике, разработанной Спэкманом, Стейном и Муром в 1958 г. [13], хроматографический анализ приблизительно 4 мг белка (гидролизата) на смоле амберлит IR—12Q длился [c.34]

В последнее время появилась возможность определять аминокислотный состав белков с помощью автоматических аминокислотных анализаторов. Когда в 1948 г. Мур и Стейн [551 в дополнение к классическим методам органической химии, а также манометрическому и бактериологическому анализу ввели ионообменную хроматографию, наступил поворотный момент в развитии химии аминокислот. В основу работы созданных сотрудниками Рокфеллеровского института современных автоматических аминокислотных анализаторов была положена ионообменная хроматография. Принцип работы этих приборов заключается в следующем. Исследуемый белок гидролизуют, затем гидролизат подвергают хроматографии на смоле типа дауэкс 50 х8 в Na-форме. Элюирование производят с помощью непрерывной подачи буферного раствора. Выходящий из колонки элюат попадает в пластмассовую ячейку особой формы, где он смешивается с раствором нингидрина. Подачу нингидрина осуществляет специальный насос, работающий синхронно с насосом, подающим буферный раствор на колонку. Затем смесь элюата с нингидрином проходит через тефлоновый капилляр, который погружен в кипящую баню. В этих условиях в растворах происходит нингидриновое окрашивание, интенсивность которого измеряется в проточной кювете спектрофотометрически. Поглощение света регистрируется самописцем. Применение сферических смол [80] позволило сократить время исследования одного образца примерно в четыре раза, а использование особых ячеек сделало вполне допустимыми для анализа очень малые количества исследуемого вещества — порядка 0,01—0,05 мкмоля [38]. Введение одноколоночной процедуры значительно упрощает метод [9, 29, 43, 60]. С помощью этой методики в одной и той же пробе можно определить кислые, нейтральные и основные аминокислоты, что не только экономит исследуемый материал, но и повышает точность и сокращает время исследования. Работая на стандартном аминокислотном анализаторе и пользуясь некоторыми модификациями известных методов, можно полностью закончить анализ одного вещества в течение 3 ч [91. [c.32]

Основные научные работы Мура, которые он проводил совместно с У. X. Стайном, посвящены исследованию строения белков. Они разрабатывали точные аналитические методы для определения аминокислотного состава белков. Развили (1951) метод ионообменной хроматографии, который применили для выделения и очистки рибонуклеазы. Благодаря сочетанию хроматографических методов анализа, разработанных Муром и Стайном, с предложенным ими фотометрическим нингидринным методом и их же автоматическим коллектором фракций они создали методику, позволяющую анализировать белковый гидролизат в течение двух недель. Применение синтетических ионообменных смол (сульфокатионитов) позволило им сократить (1950-е) это время до недели. Затем (1958) процесс ими был автоматизирован, а время анализа уменьшено до нескольких часов. Мур и Стайн установили [c.347]

В методике, предложенном Спэкманом, Стейном и Муром [86], размеры первой колонки 150 X 0,9 см, а второй 15 х 0,9 см диаметр зерен примерно 40 мк первую колонку промывают 0,2 н. раствором цитрата натрия при pH. 3,24—4,25, а вторую 0,4 н. цитратом натрия при pH 5,26. Температура колонок 50 °С. Если использовать более мелкие зерна смолы более правильной сферической формы (диаметр 22 6 мк для длинной колонки и 15 6 мк для короткой), можно сократить длину колонок до 57 и 5 см соответственно при вымывании теми же растворами со скоростью течения 1 мл/мин на полный анализ 5 мг гидролизата белка уходит 4—5 ч [88] [c.222]

Ричард [187] разработал методику двумерного разделения пептидов в одном направлении проводится хроматографическое разделение пробы, в другом — электрофорез. Адсорбентом служит силикагель G перед опытом предварительно выявляют лучший растворитель при разделении ферментативного гидролизата белков. Автор методики приводит список восьми систем растворителей. В качестве нейтральных систем можно использовать н-пропанол или 96 %-ный этанол и воду (7 3) в качестве основных систем — н-пропанол или 96 %-ный этанол и 34 %-ный гидроксид аммония (7 3) или хлороформ—метанол— 34 %-ный гидроксид аммония (2 2 1). К кислым растворителям относятся н-пропанол или 96 %-ный этанол—вода—уксусная кислота (7 2 1) или н-бутанол—вода—уксусная кислота (4 1 1). После выбора лучшего растворителя пробу подвергают хроматографическому анализу на тонкослойной пластинке размером 200x200 мм. Разделение предпочтительно вести методом восходящей хроматографии, однако при неудовлетворительном разделении можно прибегнуть и к непрерывному хроматографированию по методике Бреннера и Нидервизера [188] либо применить усовершенствованный прибор, описанный Ричардом. Пластинки затем удаляют и после 10-минутной сушки при 100 °С охлаждают и опрыскивают соответствующим буфе- [c.515]

Разработана методика, где метод изотошюго разбавления используется в сочетании с деградацией по Эдману [15], Со-1 ласно одному из вариантов этого метода, проводят одну сталию деградации но Эдману, в ходе которой блокируются е-аминогруппы остатков лизина, а затем конденсируют второй Ы-кои-невой остаток с реагентом, содержащим радиоактивную метку [94]. В этом случае нет необходимости экстрагировать производное Ы-концевой аминокислоты. Для количественного определения белка в образце используют аминокислотный анализ, а в аликвотных пробах гидролизата определяют радиоактивность. Для определения удельной радиоактивности [ С]ФИТЦ образец очищенного пептида модифицируют аналогичным образом. [c.35]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология