Нозерн

Рис. 36.5. Блоттинг-перенос. По методу Саузерна тотальную ДНК, выделенную из культуры клеток или ткани, обрабатывают одной или несколькими рестриктазами и полученную смесь фрагментов подвергают электрофорезу в агарозном или полиакриламидном геле. ДНК, несущая отрицательный заряд, мигрирует к аноду. Небольшие фрагменты двигаются быстрее крупных. После окончания электрофореза разделенные фрагменты ДНК подвергают мягкой денатурации, инкубируя гель в растворе щелочи. На следующем этапе гель накладывают на нитроцеллюлозный фильтр. Фрагменты ДНК переносят на нитроцеллюлозу с помощью методических приемов, разработанных Саузерном, и фиксируют полученную нитроцеллюлозную реплику тепловой обработкой. Далее реплику инкубируют с меченым кДНК-зондом, гибридизую-щимся с соответствующим комплементарным фрагментом ДНК на нитроцеллюлозном фильтре. После интенсивной промывки фильтр помещают на рентгеновскую пленку. Фиксируемые на радиоавтографе сигналы соответствуют расположению фрагментов ДНК, комплементарных последовательности зонда. Метод Нозерн-блот (для анализа РНК) принципиально не отличается от метода переноса по Саузерну (Саузерн-блог анализа). Тотальную РНК подвергают электрофорезу. Сама процедура переноса РНК из геля на фильтр несколько отличается от метода Саузерна, поскольку молекулы РНК менее стабильны, чем молекулы ДНК. Метод Вестерн-блот применяется для выявления определенных белков с помощью

Таблица 1.5. Нозерн -гибридизация

Методы Нозерн- и Саузерн-блоттинга позволяют гибридизовать молекулы нуклеиновых кислот, предварительно фракционированные с помощью электрофореза [44] [c.239]

Метод также можно применять и для РНК. Для переноса РНК с агарозы в среду, пригодную для проведения гибридизации, его необходимо несколько видоизменить. Такой метод известен под названием Нозерн-блоттинга . [c.243]

Перенос НК на мембранные фильтры после их фракционирования в агарозном геле (Саузерн- или Нозерн-блоты). [c.96]

Рис. 4-72. Методы Нозерн - и Саузерн -блоттинга. После электрофоретического фракционирования смеси молекул ДНК или РНК в агарозном геле проводят перенос различных фрагментов нуклеиновых кислот на лист нитроцеллюлозы или найлона ( блоттинг ). Этот лист затем инкубируют с радиоактивным ДНК-зондом в течение длительного времени в условиях, способствующих гибридизации. Затем лист тщательно промывают, гак что радиоактивно меченными оказываются лищь те фрагменты, которые гибридизуются с ДНК-зондом. На радиоавтографе,

Нозерн-блоттинг. Метод переноса РНК из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр, на котором положение определенной молекулы РНК выявляют с помощью гибридизации с радиоактивным зондом. Обратная транскрипция. РНК-зависимый синтез ДНК, катализируемый обратной транскриптазой. Палиндром. Участок двухцепочечной ДНК, в которой последовательность одной из цепей идентична последовательности другой цепи, прочитанной в обратном направлении. [c.51]

Саузерн- и Нозерн-блоты позволяют обнаружить изменения в размере молекул, т.е. выявить возможные структурные нарушения. Как правило, эти модификации используются для выявления генетических нарушений на уровне макроорганизма и потому подробно здесь не рассматриваются. [c.97]

Перенос ДНК из геля на фильтр носит название Саузерн-блоттинга в честь Эдвина Саузерна, который изобрел этот метод. Использующиеся в литературе термины Нозерн-блоттинг и Вестерн-блоттинг относятся к переносу РНК и белков соответственно. Эти названия - в переводе северный и западный -не имеют никакого отношения к сторонам света и были придуманы остроумными коллегами Саузерна (Southern - южный). Тем самым они как бы напутствовали Саузерна на разработку новых методов переноса макромолекул, а также четко обозначили, о переносе каких макромолекул идет речь. Кроме того, все увидели, что шутить умеют не только физики, но и биологи. [c.65]

В этом разделе рассматриваются основные методы использования РНК-зондов при исследовании нуклеиновых кислот в обычной лабораторной практике. В раздел включены детальные описания методов, в которых РНК используются вместо ДНК-зондов при Саузерн- и нозерн- гибридизации и в опытах по защите от действия РНКазы. [c.27]

Метод Нозерн -гибридизации по существу идентичен гибридизации по Саузерну и детально описан в табл. 1.5. [c.29]

Экспрессию вирусных РНК-транскриптов изучают с помощью стандартной процедуры нозерн -блок-анализа. При этом рабо- [c.299]

Для визуализации специфического фрагмента ДНК или РНК среди тысяч других примесных молекул используется комбинация целого ряда экспериментальных приемов, которые в совокупности получили название блоттинг . На рис. 36.5 показаны схемы проведения Саузерн-блоттинга (для визуализации фрагментов ДНК), Нозерн-блоттинга (для РНК) и ] стерн-блоттинга (для белков). Первая процедура названа по имени автора методики, остальные возникли как лабораторный жаргон, но со вре- [c.43]

Нозерн-блоттинг (Nothem blotting) Перенос молекул РНК, подвергнутых элктроферезу, с геля на твердую подложку (нитроцеллюлозный или найлоновый фильтр) с последующей ДНК—РНК-гибридизацией. [c.554]

Метод клонирования широко используют для выделения индивидуальных генов прямо из генетического материала, располагая при этом высокоспецифичными радиоактивными РНК- и ДНК-зондами Эти последние взаимодействуют только с определенными последовательностями и гибриды их с генами регистрируются радиоавтографией на рентгеновских пленках Пример анализа по Саузерну (по англ southem-blotting — промокание по Саузерну) показан на рис 67 Аналогичный подход применим и д 1 анализа РНК (метод Нозерн -блотинга) [c.194]

На НПЗ фирмы Трейт Нозерн Ойл Компани в Сант-Пауло, шт. Миннесота (США), на НПЗ фирмы "Маратон Ойл Компани в г. Робинсон, шт. Иллинойс (США) и др. На НПЗ в Сант-Пауло доочистка стоков в пруде снижает количество нефтепродуктов с 9 до 3 мг/п, фенолов с 0,3 до 0,2 мг/п на НПЗ в Робинсоне содержание фенолов после пруда уменьшается с 0,5 до 0,1 мг/л, сульфидов -с 20 мг/п до нуля, ХПК - с 125 до 90 мг/л, [c.36]

За рубежом расширяется также применение СПГ и на железнодорожном транспорте. Многолетняя безаварийная эксплуатация магистральных и маневровых тепловозов на СПГ железнодорожными компаниями Берлингтон Нозерн , Морри-сон-Кнудсен , Санта-Фе , Юнион Пасифик говорят об объективных преимуществах этого вида топлива. [c.795]

Конструирование крупных технологических линий обусловило создание заводов по производству ПЭНП другого типа — сразу на крупную мощность. Так, в США фирма Нозерн Петрокем на заводе в г. Джоллиет (Иллинойс) создала в 1972—1973 гг. производство мощностью 240 тыс. т в составе четырех технологических линий. Фирма Энджей Кем на комбинате в г. Батон-Руж (Луизиана) в конце 60-х — начале 70-х годов ввела производство мощностью 180 тыс. т в два этапа (по-видимому, две технологические лиНии). Проектируется ввод третьей линии мощностью 104 тыс. т. [c.38]

С помощью преобразователя напряжение термоэлектрогенератора можно изменять до 48 в нри силе тока до 2 а. Фирма Нозерн илли-нойс гэз также проводила испытания термоэлектрогенератора, изготовленного фирмой Вестингауз электрик корпорейшн . Однако мощность этого термоэлектрогенератора также лгала. [c.117]

Southern (Саузерн), по имени которого назван оригинальный метод, по англ. означает южный. По аналогии видоизмененный метод назван Nothern (нозерн), т.е. северный.— Прим. ред. [c.243]

Рис. 26.7. При анализе ядерной РНК с помощью блоттинга по Нозерну и гибридизации с зондом, содержащим овомукоидные последовательности, обнаруживается ряд дискретных предшественников мРНК.

Что происходит с удаленными интронными участками Эксперименты по гибридизации с популяцией ядерных РНК свидетельствуют о том, что концентрация овальбуминовых интронных последовательностей примерно в 10 раз ниже, чем концентрация последовательностей экзонов. Возможно, это означает, что удаленные из молекул интроны довольно быстро разрушаются, а предшественники, идентифицируемые при Нозерн-блоттинге или при электронно-микроскопическом анализе, представляют собой популяцию более стабильных ядерных молекул. Все промежуточные продукты, которые подвергаются более быстрому процессингу, будут присутствовать в относительно небольших количествах, так что обнаруживаемые предшественники-это промежуточные продукты, процессинг которых происходит медленно и которые поэтому присутствуют в более высоких концентрациях. [c.324]

Для анализа РНК. кодирующих альбумин, с помощью ДНК-зонда используется метод Нозерн-блоттинга. На первом этапе с помощью гель-электрофореза, фракционируют интактные молекулы РНК дефектных и контрольных клеток печени и пол чают набор полос. Для гого чтобы молекулы РНК, содержащиеся в геле, сделать более доступными ДНК-зонду, осуществляют перенос (блоттинг) фракционированных молекул РНК из геля на лист нитроцеллюлозы. На следующем этапе лист нитроцеллюлозы инкубируют с раствором, содержащим меченый ДНК-зонд. Полосы РНК, гибридизующиеся с зондом, выявляют методом радиоавтографии (рис. 4-72). Известно, что скорость движения молекул нуклеиновых кислот в геле зависит от их размера при электрофорезе малые молекулы перемещаются быстрее, чем большие. Сравнивая [c.239]

В случае Нозерн -гибридизации РНК-зонды оказались гораздо более чувствительными, чем ДНК-зонды. Мелтон и др. [5] сообщали о достигнутом ими 10-кратном повышении чувствительности метода при использовании РНК-зондов как выяснилось, это общее правило. РНК-РНК-гибриды более стабильны в растворах формамида, чем аналогичные ДНК-ДНК-гибриды, что и порождает проблему неспецифичности гибридизации. В частности, связывание некоторых зондов, обладающих способностью к перекрестной гибридизации с рибосомной РНК, стало серьезной проблемой, и для выявления специфических гибридов приходится варьировать степень жесткости отмывки. В общем случае лучше с осторожностью относиться к полосам РНК, по размеру совпадающим с 28- или 185-РНК, до тех пор, пока не будут получены еще и другие доказательства того, что они появились в результате специфической гибридизации. Для удаления неспецифических гибридов некоторые исследователи предлагают проводить отмывку в присутствии РНКазы. В этом случае фильтры нельзя использовать повторно. [c.30]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология