Белки качестве проб

Поскольку индольная флуоресценция триптофана наиболее интенсивна среди природных аминокислот, она в основном ответственна за флуоресценцию большинства белков и находит различные применения в биологии и медицине, например в качестве пробы для выяснения структурных и конформационных изменений в белках, оценки совместимости антител в иммунологии и выяснения механизма действия ферментов [136, в, 15]. Примером, в частности, может служить гидролаза — лизоцим, содержащий шесть остатков триптофана, в том числе три, по-видимому, ассоциированы с активным участком. Присоединение субстрата приводит к голубому смещению в эмиссионном спектре на 10 нм, от 335 к 325 нм, сопровождающемуся повышением квантового выхода. Такое поведение интерпретируется как указание на взаимодействие между карбоксильными и индольными группами активного центра, которое исчезает при присоединении к субстрату [16]. [c.494]

Отмытые и подсушенные с помош,ью кусочка фильтрова льной бумаги электроды полярографа осторожно опускают в кювету, заполненную 2 мл среды 1 (проба 1) до полного выхода пузырька воздуха. С помощью специального потенциометра устанавливают перо включенного самописца в исходное положение, соответствующее исходной концентрации кислорода в среде (в самописцах типа КСП-4 — в крайнее правое положение). Включают движение диаграммной ленты и, убедившись в отсутствии дрейфа, с помощью микропипетки добавляют в кювету 0,04—0,05 мл густой суспензии митохондрий (4—6 мг белка). В течение 40—60 с регистрируют медленное эндогенное дыхание и добавляют 0,02 мл сукцината (10 мМ), который вызывает небольшую стимуляцию дыхания. Через 40—60 с в кювету вносят раствор СаСЬ ( 100 мкМ). При этом дыхание сначала резко активируется, затем быстро снижается до исходного уровня. Добавку повторяют несколько раз до тех пор, пока стимуляция дыхания после каждого добавления сменяется четко выраженным торможением. Учитывая количество добавленного СаСЬ, оценивают его максимальную концентрацию, вызывающую обратимую стимуляцию дыхания. Для препарата интактных прочно сопряженных митохондрий (4—6 мг белка в кювете) эта концентрация обычно составляет 400—500 мкМ. В пробе 2 убеждаются в том, что выбранная концентрация СаСЬ вызывает обратимую стимуляцию дыхания с отчетливым выходом в контролируемое состояние. Для определения величины АДФ/О записывают следующую пробу. С этой целью в кювету со средой последовательно добавляют митохондрии, сукцинат и АДФ в концентрации от 300 до 400 мкМ (определение АДФ/О см. на с. 462). Проводят три аналогичных измерения с использованием в качестве субстрата окисления смесь глутамат—малат (по 5 мМ). В этом случае целесообразно уменьшить концентрацию добавляемого СаСЬ в 1,5—2 раза, а в среду инкубации предварительно добавить (непосредственно в кювету) 1 мМ НАД+ для предотвращения утечки эндогенных пиридиннуклеотидов. [c.452]

В КИСЛОЙ области pH (рН<2) адсорбция белков также может уменьшаться вследствие протонирования силанольных групп и устранения тем самым отрицательного заряда поверхности. В данном случае проблемы представляют очень малый ЭОП и возможная денатурация белков. Использование крайних значений pH для анализа биополимеров ограничивает селективность системы, поскольку разница в зарядах анализируемых веществ заметно уменьшается. Кроме того, выгодно иметь в качестве свободно изменяемого параметра значение pH. Скорость движения заряженных проб в КЗЭ определяется степенью их ионизации, которую можно легко регулировать величинами pH. Наилучших результатов можно достичь, выбирая высокие [c.66]

Резюмируя, можно отметить, что в случае добавок детергентов для разделения белков в КЭ многообещающим представляется использование в качестве динамических покрытий в основном неионных ПАВ, т. к. они лишь незначительно изменяют структуру заряда пробы. Конечно, этот метод включает совместное действие химического модифицирования поверхности и динамического покрытия, в результате чего преимущества доступности и простоты применения буферных добавок в конце концов теряются. [c.69]

Неблагоприятную адсорбцию белков на поверхности капилляра можно уменьшить также добавками низших полиаминов, например, 1,3-ДАП. При этом получают высокую эффективность, однако из-за большой собственной электропроводности буфера следует использовать электрические поля низкой напряженности. Действие буферных добавок, вероятно, частично объясняется необратимой адсорбцией на стенках капилляра. Поэтому одновременно со снижением адсорбции пробы происходит резкое уменьшение электроосмоса. В качестве примера на рис. 60 показано разделение стандартных белков. [c.69]

Эту реакцию широко применяли для определения меркаптогрупп в белках муки [28—31], и для нее, по-видимому, не требуется точно контролировать pH среды. В работе [32] сообщалось, что соединение I устойчиво в условиях последующего гидролиза полипептида, однако позже выяснилось, что значительная часть этого аддукта (около 20%) претерпевала дальнейший гидролиз с образованием 5-сукцинил-ь-цистеина(П) и этиламина [33]. Для того чтобы избежать необходимости вводить поправки, связанные с частичным превращением соединения I в соединение П [33, 34], было предложено вести гидролиз в условиях, обеспечивающих количественное превращение I во II [28]. Такое полное превращение можно обеспечить путем гидролиза белка, содержащего аддукт ь-цистеина и ЫЭМ(1), в 6 н. соляной кислоте в запаянной и деаэрированной трубке [29, 30] при температуре 120 °С в течение 22 ч или при температуре 110 °С в течение 72 ч [35]. Если в пробе присутствуют лишь чрезвычайно малые количества ь-цистеина, то перед гидролизом в реакционную смесь желательно добавить соединение I в качестве носителя. Для измерения радиоактивности продуктов гидролиза их нетрудно предварительно разделить методом хроматографии на бумаге. [c.354]

Рассмотренные выше обстоятельства приходится учитывать в процессе разделения белков и пептидов [106, 107]. При КЗЭ белков с немодифицированным капилляром рекомендуется после каждого проведенного разделения при вводе пробы из биологических матриц тщательно промывать капилляр раствором едкого натра. При этом молекулы, адсорбированные на стенках капилляра, удаляются. Если значения pH вьппе изоэлектрической точки (р/), то белки находятся в анионной форме, т.е. имеют тот же заряд, что и стенки кварцевого капилляра. Предпочтительный pH буфера составляет 9-11. При pH < 2 адсорбция белков уменьшается вследствие протонирования силанольных групп. Возникают проблемы иного рода очень малый ЭОП и возможная денатурация белков. Для предотвращения сорбции белков стенками капилляра к буферу добавляют соли щелочных металлов, низших полиаминов, цвиттер-ионов, обладающих большой буферной емкостью. Перспективно использование неионных ПАВ в качестве динамических покрытий. [c.350]

Очень важным является использование синтетических олигонуклеотидов в качестве гибридизационных проб (зондов) для поиска нужных рекомбинантных колоний в генноинженерных экспериментах. Олигонуклеотид синтезируется в соответствии с данными, полученными из известной структуры белка илн ДНК, и после введения концевой метки используется для гибридизации [c.378]

Поскольку аммиак и соли аммония образуются при гниении белка, наличие их в природных водах служит признаком загрязненности. Контролируя качество воды, делают пробы на присутствие катиона NH4 и некоторых других ионов. [c.121]

Применение. В качестве специфического реактива восстановительного рас- щепления дисульфидных мостиков, для стабилизации и регенерации сульфгидрильных групп, В качестве добавки к секвенатррным растворам, повышающей стабильность введенной пробы и способствующей последующему расщеплению дисульфидных связей [2]. Как активатор креатинкиназы в сыворотке крови и как реактив для количественного определения креатинфосфокиназы [3, 4] и расщепления дисульфидных связей в кератине [5], Восстанавливает дисуль-фидные связи в пептидах и белках в жидком аммиаке без каких-либо обна руживаемых побочных реакций [6]. [c.143]

Ход работы. 100 мг порошка казеина растворяют в про бирке в 3 мл 10% раствора едкого натра или кали. Пробирку закрывают пробкой со стеклянной трубкой в качестве холодильника, закрепляют ее на асбестовой сетке металлической лапкой или кольцами и нагревают (см. рис. 9). Через час после начала кипения жидкости гидролиз прекращают, жидкости дают остыть и нейтрализуют ее концентрированной азотной кислотой (12—15 капель) до слабокислой реакции на лакмус. При нейтрализации выпадает осадок высокомолекулярных продуктов неполного гидролиза белка (пептоны). После отстаивания жидкость фильтруют и с 1—2 каплями фильтрата проделывают молибденовую пробу на фосфорную кислоту (см. стр. 50). Выпадает небольшой кристаллический осадок фосфорномолибденовокислого аммония (лимонножелтого цвета). [c.54]

Применение, В качестве реактива для флуорометрического определения первичных аминов, аминокислот, пептидов, белков [1—3] предел обнаружения составляет 1-10- моль/мл в пробе и порядка 10" моль в хроматографической системе. [c.416]

Колбочки помещают в термостат аппарата Варбурга при 28° С и выравнивают температуру в течение 15 мин. В каждую колбочку добавляют по 0,1 мл густой суспензии митохондрий (6—7 мг белка) и пробы инкубируют в течение 10 мин при перемешивании. По окончании инкубации их помещают в лед и после быстрого охлаждения их содержимое осторожно наслаивают на поверхность холодного 0,88 М раствора сахарозы. Предварительно охлажденную до 0°С сахарозу разливают по 5—7 мл в четыре центрифужных стаканчика от супернасадки центрифуги ЦЛР, стоящие во льду. Пробы центрифугируют при максимальной скорости вращения 10 мин. Верхний слой отсасывают пипеткой и отбрасывают, раствор сахарозы сливают и поверхность осадков осторожно споласкивают 0,3 М сахарозой, охлажденной до 0°С. В стаканчик добавляют по 1,5 мл 1 н. хлорной кислоты, осадки хорошо размешивают стеклянной палочкой и центрифугируют при 5000 в течение 15 мин. Супернатанты собирают в пробирки и экстракцию повторяют вновь в тех же условиях. Объединенные супернатанты нейтрализуют крепким раствором МН40Н. К нейтрализованным растворам добавляют по 2 мл метилового спирта, 2,5 мл 1 М аммиачного буфера, 0,2 мл раствора цианистого калия и 0,4 мл раствора эриохро-ма черного Т в метиловом спирте. Объем доводят до 10 мл аммиачным буфером. Определяют количество Mg + в пробах, измеряя оптическую плотность при 520 нм против раствора, не содержащего Mg +. Калибровочную кривую строят одновременно с обработкой опытных проб, используя в качестве стандарта титрованный раствор Mg l2. Область концентраций, в которой сохраняется линейная зависимость между количеством Mg + и оптической плотностью, — О—0,3 мкмоль Mg2+ на пробу. [c.457]

Немедленно после внесения субстрата и перемешивания начинают регистрировать прирост оптической плотности в пробе при 254 нм, используя в качестве контроля 0,5 мМ раствор ГАК-H l в том же буфере. Первый отсчет, величина которого определяется содержанием белка в пробе, принимают за нулевой далее измерение проводят в течение 5 мин, делая отсчеты через каждые 30—60 с. По окончании измерения вычисляют величину AD254 за 1 мин, используя только линейную часть кривой зависимости прироста оптической плотности от времени. Поскольку абсолютная скорость реакции невелика (Д0254 за 1 мин составляет 0,007—0,009), необходима большая тщательность при выполнении всего анализа постановка параллельной пробы обязательна. Следует строго следить за поддержанием температуры на необходимом уровне (37 °С), так как данная ферментативная реакция отличается высоким температурным коэффициентом. [c.183]

Принципиальными отличиями эксклюзионной хроматографии от других вариантов являются заранее известная продолжительность анализа в конкретной используемой системе, возможность предсказания порядка элюирования компонентов по размеру их молекул, примерно одинаковая ширина пиков во всем диапазоне селективного разделения и уверенность в выходе всех компонентов пробы за достаточно короткий промежуток времени, соответствующий объему У . Хотя данный метод применяют, главным образом, для исследования ММР полимеров и анализа макромолекул биологического происхождения (белки, нуклеиновые кислоты и т.д.), указанные особенности делают его чрезвычайно перспективным для анализа низкомолекулярных примесей в полимерах и предварительного разделения проб неизвестного состава. Получаемая при этом информация существенно облетает выбор наилучшего варианта ВЭЖХ для анализа данной пробы. Кроме того, микропрепаративное эксклюзионное разделение часто используют в качестве первого этапа при разделении сложных смесей путем комбинации различных видов ВЭЖХ. [c.42]

Аналогичным методом определяли аминогруппы, содержащиеся в липидах [100]. В работе 101] описано определение различных аминокислот в пробах белка величиной 2 мкг с применением изотопа Н в качестве индикатора. С применением реагента, меченного изотопом Н, и индикаторного изотопа (в виде N-ацетильного производного) или определили тироксин (3,5,3, 5 -тетраиод-трионин) [102]. Кроме этого, используя уксусный ангидрид, меченный тритием, для образования производных, и ацетил- С-произ-водное в качестве индикатора, определили 3-иодтирозин и 3,5-ди-иодтирозин [103]. Вместо моноацетильных производных тироксина и трииодтрионина в работе [104] рекомендуется применять их ди-ацетильные производные, которые более стабильны, более растворимы в полярных растворителях и легче очищаются. [c.313]

Для определения воды в белках Свенпоэл и ван-Ренсбург [176] применили метод, основанный на измерении удельной теплопроводности. Этот метод представляет собой модификацию автоматической методики Симона и сотр. [165], разработанной для определения углерода и водорода. При температуре печи 180 °С вода удаляется из многих материалов без разрушения образца. При выполнении типичных анализов пробу шерсти массой 5—10 мг помещали в трубку для сожжения при температуре 180 10 °С. В качестве газа-носителя использовали гелий, и количество паров воды определяли с помощью детектора по удельной теплопроводности. В табл. 11-11 приведены данные определения воды в некоторых белках описанным методом в сопоставлении с обычным высушиванием в сушильном шкафу. Авторы подчеркивают, что для выполнения анализа достаточно 1 мкг образца. Существует серийный прибор для таких определений. [c.590]

Для выявления качества избыточного ила в лабораторюа условиях ил отбирался с регенераторов аэротенков. Пробы подвергались кислотно-щелочной обработка для того, чтобы "убить" Иикро-организмы. После обработки ил становится рыхлый, светло-коричневого цвета. После фильтрования ил высушивается прй теипера-туре Ю5-130°С. В его составе содерхатоя белки, липиды< углеводороды, зола. [c.114]

Итак, в ситовой хроматографии для хорошего разделения нужны достаточно длинные колонки. Вследствие того что коэффициент К не может превышать 1, при величине объема элюирования, равной у у колонке не остается вешества. Поэтому можно подобрать время ввода образцов таким образом, чтобы избежать частичного перекрывания предыдущей и последующей проб и разделять на одной колонке одновременно несколько образцов. Вначале в ситовой хроматографии чаще всего использовались водные растворы, а в качестве неподвижной фазы применялись сшитые декстраны. Когда эти гели набухают, они тановятся сравнительно мягкими. В основном разделение на декстранах проводили в стеклянных колонках при малой скорости потока растворителя. Гели главным образом применяют для разделения биохимических вешеств, а также для определения молекулярных весов. В последнем случае наибольший успех был достигнут при исследовании глобулярных белков. В данной главе основное внимание будет уделено разделению с помощью неводных растворителей Неподвижные фазы, используемые при работе с водными растворами, не могут применяться в случае органических растворителей, так как они не набухают и остаются непроницаемыми. Д р /2/ об- [c.109]

Высушенный препарат измельчают на шаровой мельнице в порошок тонкого помола. Соотношение веса сухой массы фермента к весу шаров 1 5, число оборотов мельницы 18—20 в минуту. Размол длится обычно 4 ч чем он происходит быстрее, тем лучше. Сухой порошок просеивают через шелковое сито, а отсев вторично измельчают и просеивают. В пробе готового препарата определяют активность. Она составляет для данного препарата около 10000 единиц (1 10000), т. е. грамм препарата переваривает 10 кг коагулированного яичного белка в условиях, рекомендуемых Госформакопеей. В качестве примесей полученный высокоактивный препарат содержит Na l и некоторое количество пептидов. Его устойчивость очень высока хранить сухой порошок можно при комнатной температуре. [c.203]

Несмотря на то что полиакриламид стал применяться в качестве носителя для электрофореза лишь после 1960 г., этот материал в настоящее время наиболее широко используется при разделении смесей макромолекул кислого или основного характера. Сейчас полиакриламидный гель как носитель практически вытеснил бумагу и крахмальный гель, поскольку в случае белков и нуклеиновых кислот он дает очень хорошее разрешение. Гель получают полимеризацией акриламида в присутствии метиленбисакриламида или других соединений, служащих сшивающими агентами. В работе Сарджента [3] подробно описаны способ получения гелей, процедура нанесения пробы и условия разделения. [c.138]

На рис. 3.28 показано приспособление, используемое для колориметрического анализа микропроб методом движущейся ленты. В устройстве используется три ленты, движущихся в одном направлении. Проба осаждается и абсорбируется дисками из фильтровальной бумаги ватман прикрепленными к поддерживающей найлоновой ленте. Реагент подается из вращающегося керамического ролика на ленту из бумаги ватман №3. В качестве средства грубого разделения используется промежуточная лента, Папример, лента из целлофана будет препятствовать переходу белков на ленту с реагентом, а аце-татцеллюлозная лента с размером пор 0,06 нм отделяет белки от эритроцитов, позволяя определять белки в цельной крови. Последовательность операций ясна из рис. 3.28. После осаждения пробы в центре поглощающего диска найлоновая лента проходит под роликом и приводится в контакт с промежуточной лентой и лентой с реагентом. Многослойная лента проходит под нагретыми до 37 °С прессовальными пластинками, что обеспечивает завершение реакции с красителем. Лента, которая теперь несет ряд окрашенных пятен, пропускается [c.169]

В качестве примера ниже приведена методика карбоксиметилирования сывороточного альбумина быка [81]. Раствор, содержа-ш,ий 500 мг кристаллического белка, 6 ммоль бромацетата и избыток окиси магния, осторожно встряхивают при 35°. За ходом реакции следят, отбирая пробы смеси для анализа различными метода-ьш. Полезными критериями для наблюдения за ходом реакции могут служить убыль аминного азота и отрицательный результат диазосочетания имидазольных и фенольных остатков. В случае бычьего сывороточного альбумина по мере протекания карбокснметилиро-вания дисульфидные связи становятся более доступными восстановлению это можно обнаружить, обрабатывая препарат сначала сульфитом, а затем раствором фосфомолибденовой кислоты по Фолину 82]. Спустя 27—72 час смесь центрифугируют и прозрачную надосадочную жидкость подкисляют до pH 2 соляной кислотой. Практически количественный выход карбоксиметилированного белка. [c.179]

Ричард [187] разработал методику двумерного разделения пептидов в одном направлении проводится хроматографическое разделение пробы, в другом — электрофорез. Адсорбентом служит силикагель G перед опытом предварительно выявляют лучший растворитель при разделении ферментативного гидролизата белков. Автор методики приводит список восьми систем растворителей. В качестве нейтральных систем можно использовать н-пропанол или 96 %-ный этанол и воду (7 3) в качестве основных систем — н-пропанол или 96 %-ный этанол и 34 %-ный гидроксид аммония (7 3) или хлороформ—метанол— 34 %-ный гидроксид аммония (2 2 1). К кислым растворителям относятся н-пропанол или 96 %-ный этанол—вода—уксусная кислота (7 2 1) или н-бутанол—вода—уксусная кислота (4 1 1). После выбора лучшего растворителя пробу подвергают хроматографическому анализу на тонкослойной пластинке размером 200x200 мм. Разделение предпочтительно вести методом восходящей хроматографии, однако при неудовлетворительном разделении можно прибегнуть и к непрерывному хроматографированию по методике Бреннера и Нидервизера [188] либо применить усовершенствованный прибор, описанный Ричардом. Пластинки затем удаляют и после 10-минутной сушки при 100 °С охлаждают и опрыскивают соответствующим буфе- [c.515]

Эта методика не дала удовлетворительного выделения пестицидов из пробы, поэтому через год Р. А. Mills (1961) опубликовал модифицированную методику, позволяющую полнее извлекать пестициды. Она была опробована в США, получила положительные отзывы и стала официальным методом определения пестицидов в молоке и молочных продуктах. В отличие от первого варианта пестициды экстрагировали не тройным, а одинарным объемом смеси 1 1 серного и петролейного эфиров. Полнота отделения эфирного экстракта обеспечивалась центрифугированием. В результате практически полностью извлекали хлорорганические пестициды и 93— 95% жира. Ценность этой методики определяется тем, что она легла в основу нового методического подхода к анализу пестицидов — созданию условий для полного выделения их из проб молока путем коагуляции белков, приводящей к разрыву оболочек жировых шариков и дающей возможность отделить белковую часть молока отстаиванием, фильтрованием или центрифугированием. Немаловажно использование в качестве добавки оксалата калия, который гидрофилизирует белковый сгусток, [c.192]

Ряд исследователей для разрушения оболочек жировых шариков обезвоживали молоко, а затем экстрагировали пестициды неполярными растворителями. В качестве обезвоживающего средства часто использовали безводный сульфат натрия. Так, при экстракции хлорофоса Л. А. Стемпковская, В. В. Храпак (1971) смешивали молоко с сульфатом натрия и минеральной кислотой, а затем из кашеобразной смеси извлекали инсектицид этиловым эфиром. Такой способ приемлем и при экстракции стойких хлорорганических пестицидов, поскольку оболочки жировых шариков разрушаются в этом случае не только в результате обезвоживания белков, но и вследствие абразивного действия кристаллов соли при перемешивании пробы. Этот методический прием был использован при экстракции некоторых пестицидов (С. F. Meyer и др., 1960 Т. S. Rumsey и др., 1967) из различных биологических объектов. [c.200]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология