Профиль градиента сахарозы

ПРОФИЛЬ ГРАДИЕНТА САХАРОЗЫ [c.213]

При подаче в ротор линейного градиента, т. е. раствора, в котором концентрация сахарозы увеличивается пропорционально объему подаваемой жидкости, в нем создается нелинейный — вогнутый — градиент концентрации сахарозы ( эффект радиального разбавления ). Это легко понять, если мысленно рассмотреть положение внутри зонального ротора двух одинаковых объемов подаваемого линейного градиента сахарозы, из которых один взят из начального, а другой — из конечного участка этого градиента. Каждый из двух одинаковых объемов обусловливает один и тот же прирост концентрации сахарозы (условие линейности подаваемого в ротор градиента). В цилиндрической пробирке бакет-ротора этим одинаковым приростам плотности соответствуют и одинаковые участки длины пробирки, так как сечение ее неизменно. Градиент оказывается линейным по длине, вдоль пути миграции молекул. В зональном же роторе двум оди> наковым объемам соответствуют цилиндрические слои разной толщины большей близ центра и меньщей у его периферии. Это означает, что один и тот же прирост концентрации сахарозы будет растянут во внутренней зоне градиента и сжат вблизи наружной стенки ротора. Иначе говоря, градиент плотности будет характеризоваться увеличением крутизны своего профиля при переходе от внутренней зоны к периферической, т. е. будет вогнутым. В целях получения более близкого к линейному профиля градиента в ротор подают иногда не линейный, а выпуклый (например, экспоненциальный) градиент сахарозы (см. выше). [c.275]

Как же рассчитать константу седиментации, используя результаты эксперимента Эта задача очень упрощается, если профиль градиента плотности таков, что увеличение радиуса компенсируется изменениями плотности и вязкости среды вдоль него, и все частицы движутся с постоянными скоростями, которые определяются только их размерами. Градиенты, отличающиеся такой особенностью, называют изокинетическими . Подчеркнем, что изокинетичность градиента определяется геометрией ротора и распределением концентрации (например, сахарозы) вдоль пробирки. [c.204]

Если же в состав препарата входят частицы с очень больщи-ми значениями константы седиментации и есть необходимость затормозить их оседание при подходе ко дну пробирки, то используют либо более крутые линейные градиенты (с диапазоном 20 или 25%), либо градиенты вогнутой формы. Увеличение крутизны градиента приводит к сужению полос (зон) частиц. Передний край зоны, вступая в область повышенной вязкости и плотности раствора сахарозы, замедляет свое движение по сравнению с задним краем. Однако по той же причине уменьшается и расстояние между зонами, поэтому разрешение (разделение) зон или пиков не очень зависит от крутизны градиента. Если разделяют вещества с близкими значениями ао, . то берут пологие градиенты плотности, а узость зон стараются обеспечить за счет тонкости начального слоя. Компенсировать при этом уменьшение объема препарата за счет увеличения концентрации вещества в нем можно лишь в определенных пределах. Дело в том, что плотность раствора препарата накладывается на плотность градиента сахарозы. В силу диффузии препарат внутри зоны распределен неравномерно, профиль распределения имеет форму колокола. Если концентрация препарата в зоне невелика, то это наложение не нарушит общего характера нарастания плотности градиента вдоль пробирки. Если же концентрация вещества в зоне значительна, то у переднего ее края образуется локальный участок обратного градиента плотности , т. е. плотность на этом участке убывает (за счет препарата) в направлении от мениска к дну пробирки. Это приводит к конвекции жидкости и размыванию зоны. Ясно, что чем круче градиент плотности сахарозы, тем меньше скажется на нем вклад плотности препарата. Именно поэтому для пологих градиентов сахарозы следует опасаться перегрузки зон при увеличении концентрации препарата в исходном слое. Довольно часто плохое разрешение зон при зональ- [c.213]

Детальную характеристику действия препарата на синтез отдельных классов РНК получают, анализируя РНК полирибосом в градиенте плотности сахарозы. Для выделения РНК из полирибосом их суспендируют в буфере Б, к суспензии добавляют додецилсульфат натрия до 0,5% и ЭДТА до 5 мМ, после чего раствор инкубируют при 37 С в течение 1 мин. Для анализа профилей РНК используют градиент концентрации сахарозы 5— 20%, приготовленный на буфере Б. Центрифугируют в течение 15 ч при 50000 g (бакет-ротор SW 25.2 центрифуги Спинко , 20000 об/мин) при 3 С. Фракции, соответствующие пикам в градиенте, содержащие рРНК и мРНК, используют для определения удельной радиоактивности РНК после осаждения материала 10% раствором ТХУ. Для количественного осаждения к пробам перед добавлением ТХУ приливают по 3 капли 1% раствора дрожжевой РНК. Осажденный материал наносят на миллипоровые фильтры и измеряют радиоактивность. Результаты выражают в имп/мин на мг РНК и ДНК клеток. [c.292]

Рис. бК Профиль фракционирования полисом печени крысы центрифугированием в градиенте плотности раствора сахарозы [Ramsey, Steele, 1976] [c.235]

В начале главы были указаны причины относительно редкого использования глицерина для создания градиентов плотности при зонально-скоростном центрифугировании. Главным его недостатком является более высокая вязкость растворов по сравнению с растворами сахарозы той же плотности. Однако недавно повышенная вязкость концентрированных растворов глицерина была использована для фракционирования относительно тяжелых оЛигонуклеосом. Хроматин после обработки его микрококковой нуклеазой фракционировали в градиенте 7,6— 76% (по объему) глицерина при 130 ООО g в течение 16 ч. Профиль олигонуклеосом от моно- до пентамеров равномерно распределялся по этому градиенту [Rennie, 1979]. [c.239]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология