Ксантиноксидаза сигналы ЭПР

Все изученные к настоящему времени субстраты ксантиноксидазы индуцируют появление быстрого сигнала, который представляет собой сложную суперпозицию по крайней мере четырех индивидуальных спектров ЭПР. Интенсивность быстрого сигнала коррелирует с активностью фермента, как это следует из сопоставления активности, спектров ЭПР и оптического поглощения [51], и, следовательно, этот сигнал обусловлен активным ферментом. Восстановление ксантиноксидазы дитионитом, формальдегидом или салициловым альдегидом приводит к появлению идентичных быстрых сигналов, состоящих из двух компонент, указывающих на наличие двух неэквивалентных молибден (У)содержащих центров. Поскольку маловероятно, чтобы дитионит или продукт его окисления связывался с ферментом, было высказано предположение, что эти сигналы обусловлены незакомплексованным активным ферментом и что если фермент содержит два независимых каталитических центра, то химическое окружение атома молибдена в этих центрах неодинаково. В присутствии ксантина в качестве субстрата появляются два сигнала, соответствующие восстановленному активному ферменту при [c.278]

Точный механизм участия молибдена в катализе неизвестен. Состояния Мо(1П) и Mo(V) парамагнитны, но легко регистрируемые ЭПР-сигналы отвечают лишь состоянию Mo(V). Этот сигнал легко распознать по его характерной сверхтонкой структуре, содержащей шесть линий. Такой сигнал был зарегистрирован в случае ксантиноксидазы, нитратредуктазы и сульфитоксидазы при их взаимодействии с субстратами. Однако нитрогеназа дает только сигналы ЭПР, характерные для железа. Более того, нет никаких данных, из которых следовало бы, что N2 в нитрогеназе реагирует непосредственно с атомами молибдена. Тем не менее заманчиво предположить, что присутствие молибдена в нитрогеназе связано со способностью Mo(VI) акцентировать три электрона с образованием Мо(П1). Два атома Мо(П1), отдавая далее по три электрона, могли бы доставить те шесть электронов, которые нужны для осуществления реакции (14-10). [c.86]

Ксантиноксидаза в состоянии покоя или окисленный фермент в отсутствие субстрата не дает сигнала ЭПР [44, 45]. Характерная сверхтонкая структура молибденового сигнала появляется при восстановлении субстратом в мягких условиях и вновь исчезает при восстановлении в жестких условиях. В ранних работах, выполненных методом ЭПР, было показано, что в ходе восстановления сначала появляется сигнал Мо(У), затем сигнал флавосемихино-на, а затем железа [44, 46]. [c.277]

Рис. 38. Спектры ЭПР Мо(У) восстановленной ксантиноксидазы. а —сочень быстрый сигнал (в ранних источниках обозначался также как сигнал -(5 фермент, обогащенный Мо и восстановленный ксантином, при pH 10 в течение 10 мс) б —сочень быстрый сигнал (нативный фермент условия восстановления, как в случае а) в — быстрый сигнал (в ранних источниках обозначался также как сигнал оср нативный фермент, восстановленный дитионитом, при рн 8,2 в течение 1 с) г—смед-ленный сигнал (фермент, восстановленный дитионитом, при pH 8.2 в течение 30 мин или неактивный фермент) а — подавленный сигнал (фермент диализовали против аэрированного 1 М метанола, содержащего салициловый альдегид, в течениеиескольких дней при 5 С).

В результате детального исследования различий в редуктазных реакциях при различных комбинациях альдегидоксидазы, ингибиторов и акцепторов электрона был сделан вывод [63], что имеется линейная последовательность по крайней мере четырех переносчиков электронов в молекуле фермента, причем восстановление молекулярного кислорода в этой цепи осуществляется в последнюю очередь. Этими четырьмя переносчиками, по-видимому, являются молибден, кофермент р, ФАД и Ре. Дальнейшие сведения о природе электрон-транспортной цепи были получены из опытов, выполненных методом ЭПР. Альдегидоксидаза отличается от ксантиноксидазы в том отношении, что покоящийся фермент дает слабый сигнал ЭПР Мо(У) с -фактором, равным 1,97, который соответствует примерно 3% всего содержания молибдена в ферменте. При инкубации Армента с избытком субстрата интенсивность сигнала возрастает, но только до уровня, соответствующего 15—20% полного содержания молибдена. В тех же условиях около 24% флавина находится в виде семихинонного радикала = 2,00), а 25% железа — в восстановленной форме [60, 61 ]. [c.286]

Было показано, что сульфитоксидаза — простейший молибденсодержащий фермент, в состав которого входят только две про-стетические группы — молибденовая и гемовая. Данные спектроскопии ЭПР и результаты ингибиторного анализа показывают, что молибден входит в состав центра, связывающего сульфит, и что металл в этом центре активного фермента находится в состоянии Мо(У). Двухэлектронный окислительный субстрат - молекулярный кислород, вероятно, связывается с гемовой группой, хотя прямых доказательств этого не получено. Сходство в спектрах ЭПР сульфитоксидазы и ксантиноксидазы указывает на общность структуры окружения молибдена в этих двух ферментах. Потребуются дальнейшие эксперименты с сульфитоксидазой того же типа, что и исследования, выполненные методом ЭПР в случае ксантиноксидазы, для того чтобы уточнить пределы аналогии в структуре этих ферментов. Сульфитоксидаза птиц [97] очень близка к сульфитоксидазе из бычьей печени [96]. Анионы подавляют реакции обоих ферментов с одноэлектронными акцепторами. Кроме того, они влияют на седиментационные свойства сульфитоксидазы птиц и на сигнал ЭПР Мо(У). Причины этих эффектов пока неизвестны. [c.300]

В СВЯЗИ С проблемой исследования молибденовых ферментов наибольший интерес представляет обнаружение слабого сигнала ЭПР водных растворов Мо(У) и цистеина [П7]. Хотя этот сигнал соответствует менее чем 1% всего молибдена (тогда как в случае ксантиноксидазы и сульфитоксидазы сигнал ЭПР соответствует до 50% молибдена), его появление указывает на возможность равновесия типа диамагнитный димер парамагнитный мономер. Наличием такого равновесия было объяснено несоответствие между величиной сигнала ЭПР и содержанием молибдена в ферментах [61 ]. Стабильность и интенсивность сигнала ЭПР растворов Мо(У) и цистеина критически зависит от концентрации компонентов, pH и природы буфера. В 1 М фосфатном буфере (pH 6) при концентрации Мо(У) 10 М наблюдается слабый неустойчивый сигнал ЭПР [117]. Однако Хуанг и Хэйт [118] получили вполне устойчивый, хорошо разрешенный сигнал ( г = 2,029, = 1,972, == 1,931 Л(9 Мо), 22 = 5,4, уу = 2,4,. гл = 3,4 мТ) при pH 7 —10 в 0,2 М фосфатном буфере при концентрации Мо(У) 10 М. При введении цистеина в раствор Мо(У) наблюдаются два изменения окраски. Сигнал ЭПР появляется при втором переходе. Интенсивность сигнала ЭПР пропорциональна квадратному корню из концентрации молибдена. Эти наблюдения подтверждают, что сначала Мо(У) и цистеин образуют диамагнитный димер, который затем диссоциирует с образованием парамагнитного мономера. С повышением температуры интенсивность сигнала ЭПР уменьша- [c.305]

Прямые доказательства участия молибдена в связывании субстрата и в каталитической фазе ферментативного цикла получены только для ксантиноксидазы. Отчетливое сходство между параметрами спектров ЭПР и субстратной специфичностью этого фермента и альдегидоксидазы приводит к выводу, что молибден находится и в связывающем центре альдегидоксидазы. Ограниченные данные по ЭПР позволяют предположить, что молибден участвует и в структуре связывающего центра нитратредуктазы из М. (1епИг111сапз, а также сульфитоксидазы млекопитающих и птиц. Исследования молибденовых комплексов как моделей ферментов сосредоточились в основном на комплексах с серусодержащими лигандами, особенно с цистеином, хотя и не получено надежных доказательств того, что в ферментах молибден действительно связан с серой. Молибден-цистеиновый комплекс проявляет редуктазную активность в отношении ряда субстратов, которые в то же время являются и субстратами нитрогеназы, однако в присутствии этих модельных комплексов обнаруживаются лишь следы аммиака от восстановления азота. Модельные комплексы существенно отличаются от ферментов и по количеству молибдена, который проявляет себя в спектрах ЭПР. Спектры ЭПР ферментов соответствуют до 50% общего содержания в них молибдена, тогда как модельные комплексы дают сигнал, соответствующий не более 4% содержащегося в них молибдена. Возможно, что конформация белка в области активного центра фермента стабилизирует каталитически активную мономерную структуру молибденового комплекса. Однако в отсутствие надежных структурных данных все это, как и различные схемы механизма нитрогеназной реакции, не более чем умозрительные предположения. [c.327]

За сигналом потерявшего электрон ксантина почти мгновенно появляется сигнал от молибдена, и лишь через некоторое время появляется сигнал от свободного радикала FADH, после чего следует сигнал от изменившего валентность иона железа. Очень важно [34], что если вместо ксантина взять другие субстраты (салицилальдегид, дитионат натрия), то за их сигнало.м сразу идет сигнал от FAD. Это говорит о том, что ксантиноксидаза может проводить реакции окисления различным образом. В то время как для ксантина окисление субстрата на ферменте происходит с участием иона молибдена, салицилальдегид воздействует прямо на FAD. [c.196]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология