Нуклеотиды выбор полимеразой II рис

ДНК-полимераза имеет один центр связывания нуклеозидтрифосфата, общий для всех четырех нуклеотидов. Выбор Р13 среды нуклеотида, основание к-рого комплементарно очередному основанию матрицы, протекает без ошибок, блаюдаря определяющему влиянию ДНК-матрицы (исходно] цепи ДНК). При нек-рых мутационных повреждениях структуры ДНК-полимеразы в ряде случаев происходит включение некомплементарных нуклеотидов. [c.252]

Каким образом клеткам удается достичь столь высокой степени точности в выборе нуж ного основания в процессах репликации и транскрипции, а также при спаривании кодона с антикодоном в процессе синтеза белка В ранних работах исследователи часто высказывали мнение, что специфичность спаривания оснований определяется исключительно образованием двух (или соответственно трех) водородных связей и стабилизацией за счет взаимодействия соседних участков спирали. Оказалось, однако, что свободная энергия образования пар оснований мала (гл. 2, разд. Г, 6), а дополнительная свободная энергия, обусловленная связыванием основания с концом уже существующей цепи, не в состоянии обеспечить специфичность спаривания. Исходя из современных энзимологических данных, можно предположить, что важную роль в обеспечении правильности спаривания играет сам фермент. РНК- и ДНК-полимеразы — достаточно крупные молекулы. Следовательно, связывающее место фермента может полностью окружить двойную спираль. Если это так, то нетрудно представить себе, что лроцесс выбора основания может протекать так, как это показано на рис. 15-5. На приведенном рисунке изображено гуаниновое основание матричной цепи молекулы ДНК, расположенное в месте наращивания комплементарной цепи (ДНК или РНК) с З -конца. Для образования правильной пары оснований соответствующий нуклеозидтрифосфат должен быть пристроен до того, как произойдет реакция замещения, в результате которой нуклеотид присоединится к растущей цепи. Предположим, что у фермента есть связывающие места для дезоксирибозного компонента матричного нуклеотида и для сахарного компонента включающегося нуклеозидтрифосфата, причем эти места расположены на строго оцределенном расстоянии друг от друга. Как показано на рис. 15-5, в каждом связывающем [c.212]

РИС. 15-5. Выбор Правильного нуклеотида для следующей структурной единицы раС-тущей цепи РНК или ДНК. Показан дезоксигуанозин матричной цепи, связанный с гипотетическим участком ДНК-полимеразы. [c.213]

Имеются доказательства того, что происходит симметричный, но сложный процесс непрерывной репликации на обеих цепях. Раскручиванию двунитевой ДНК способствует связывание с многочисленными белковыми частицами, которые прикрепляются к родительской ДНК в выбранном месте инициации н им удается оставить разделенными комплиментарные цепи ДНК, готовые для нового синтеза. Далее определенная РНК-полимераза синтезирует короткую РНК, длиной 01 20 до 25 нуклеотидов, которая комплиментарна родительской ДНК и связывается с ее цепью. Эта РНК действует как затравка для действия большого объемистого фермента ДНК-полимераза 1П, который теперь создает новую цепь ДНК длиной примерно в 1000 остатков, являющуюся продолжением этой РНК. Такой синтез идет в направлении 5 3 путем конденсации дезоксинуклеозид-5 -трифосфатов с З -концевой гидроксильной группой на обеих цепях родительской ДНК показано стрелками на схеме (3) . Поскольку фермент работает в условиях, близких к обратимости, это обеспечивает максимальный термодинамический контроль за правильностью выбора встраиваемых дезоксирибонуклеозидов путем спаривания их оснований с соответствующими основаниями в существующей цепи. Таким путем на каждой родительской пепи располагается ряд блоков, называемых фрагментами Оказаки. [c.199]

Все четыре нуклеозидтрифосфата могут поступать в участок элонгации нуклеотидов. По-видимому, сама РНК-полимераза отбирает нужные предшественники путем спаривания новоприбывшего нуклеотида с цепью ДНК-матрицы. Возможно, структура участка элонгации такова, что фосфодиэфирная связь образуется лишь в том случае, если нуклеотид формирует правильную пару с соответствующим основанием ДНК. Если же оказалось, что нуклеотид не способен образовать совершенную пару, то он скорее всего удаляется и вместо него испытывается другой. (Вероятность случайного правильного выбора нуклеотида равна примерно 25%, что намного превосходит вероятность вхождения правильной амино-ациЛ тРНК в А-участок рибосомы, составляющую всего лишь 3%.) [c.136]

Все ДНК-полимеразы про- и эукариот обладают одной и той же основной синтезирующей активностью. Каждая из них способна удлинять цепь ДНК, последовательно наращивая по одному нуклеотиду к З -ОН-кон-цу. Таким образом, синтез новой цепи осуществляется в направлении 5 - 3. Реакция схематически изображена на рис. 32.7. Предшественником синтеза ДНК служит ну-клеозидтрифосфат, который в процессе реакции утрачивает две конечные фосфатные группы. Выбор нуклеотида, добавляемого к цепи, диктуется спариванием основания с матричной цепью. [c.414]

Выбор конкретной ДНК-полимеразы зависит от целей эксперимента. Ферменты, обладающие более высокой точностью синтеза ДНК, и меньшей частотой включения в продукт ПЦР ошибочных (некомплементарных матрице) нуклеотидов, как правило, обладают 3 5 -экзонуклеазной (корректирующей) активностью. В том случае, если на 3 -конец строящейся цепи ДНК включается некомплементарный матрице нуклеотид, он удаляется из цепи с участием этой активности ДНК-полимеразы. К сожалению, наиболее широко распространенная в настоящее время Taq-ДНК-полимераза, такой активностью не обладает, а следовательно, точность синтеза ДНК этим ферментом невелика по сравнению с ДНК-полимеразами, способными корректировать собственные ошибки. К последним ферментам относятся, например, Pfu-, Vent- и Deep Vent-ДНК-полимеразы. [c.198]

Следует отметить, что, несмотря на довольно большой выбор ферментов и соответствующих меченых нуклеотидов для мечения фрагментов ДНК по 3 - или 5 -концам, наиболее часто используемыми являются варианты с применением полинуклеотидкиназы фаза Т4 для мечения 5 -выступающих концов и Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I для мечения 3 -углубленных концов ввиду более высокой эффективности и относительной простоты данных процессов. Дополнительным удобством является то, что Кленовский фрагмент ДНК-полимеразы I хорошо работает в большинстве рестрикционных буферов, и, таким образом, реакции расщепления и последующего мечения можно проводить в одной пробирке и даже совместно, что впрочем нежелательно из-за все-таки имеющейся 3 —> 5 -экзонуклеазной активности у этой ДНК-полимеразы. [c.24]

Нз клеотидная последовательность фрагмента ДНК, в пределах которой предполагается выбрать участок для синтеза праймера, должна быть уверенно прочитана . Следует исключить сомнительные последовательности, допускающие их неоднозначное прочтение . Преследуя цель синтеза минимального количества праймеров, необходимых для завершения определения нуклеотидной последовательности протяженного фрагмента ДНК, надо располагать новый праймер возможно близко к 5 -концу уже известной последовательности, но, как правило, чтобы его 3 -конец находился не ближе 20-50 нуклеотидов от края. Конкретное расположение места для отжига праймера во многом зависит и от особенностей самой последовательности ДНК, где надо принимать в расчет и ее G -состав, и возможные повторяющиеся элементы, и участки со значительной (потенциальной) вторичной структурой. Не последнюю роль при выборе праймера играет и температура отжига синтезируемых олигонуклеотидов, которая обычно рекомендуется в пределах 40°-50°С при предполагаемой использовании в качестве ДНК полимеразы секвеназы в 60°-70°С для термостабильных ДНК-полимераз. Кроме ОС-состава, температура отжига праймеров в значительной степени зависит и от их длины, обычно выбираемой в пределах 15-22 нуклеотидов. Для более точного определения температуры плавления олигонуклеотидов в расчет принимаются не только сами основания, но и их ближайшее окружение, что может быть проведено с помощью специализированных компьютерных программ, подробнее рассмотренных в соответствующей главе. Однако грубый подсчет температуры плавления праймеров может быть проведен вручную с помощью следующей формулы [c.62]

Реакцию синтеза ДНК с участием ДНК-полимеразы (например в ПЦР) часто называют самовоспроизведением ДНК, а молекулу ДНК — единственной самовос-производящейся молекулой. В действительности самовоспроизведение — свойство гораздо более сложных систем. В самом деле, в репликации ДНК обязательно участие ДНК-полимеразы, причем этот фермент не только катализирует образование 3, 5 -фосфодиэфирной связи, но и определяет, наряду с ДНК-матрицей, правильный выбор очередного нуклеотида. Иначе говоря, ДНК не сама воспроизводится, а синтезируется аппаратом, содержащим ДНК-матрицу и белок ДНК-полимеразу. И эта двухкомпонетная система не самовоспроизводится, поскольку количество ДНК-полимеразы не увеличивается (наоборот — уменьшается в результате денатурации соответственно убывает скорость репликации). Для того, чтобы эта система самовоспроизводилась, ьгужен механизм синтеза ДНК-полимеразы. А для этого требуется наличие гена ДНК-полимеразы в ДНК-матрице, и еще множества генов, кодирующих белки, необходимые для экспрессии (транскрипции и трансляции) всех этих генов. Колоссальное усложнение системы Однако и это далеко не все. Многие вещества, необходимые для самовоспроизведения, нестабильны, и в пище практически отсутствуют, например ьгуклеозидтрифосфаты), следовательно должны быть механизмы их образования в самой системе, т. е. нужен метаболизм. А это значит, что требуется еще много генов и соответствующих белков. [c.188]

Механизм, с помощью которого ДНК-полиме-раза катализирует полуконсервативньгй синтез новых цепей ДНК, был описан в разд. 2.1.д. Цепи удлиняются путем последовательного присоединения нуклеотидов к праймеру со свободной З -гид-роксильной группой выбор нуклеотидного остатка на каждом этапе определяется ДНК-матрицей. ДНК-полимераза I Е. соН катализирует и некоторые другие важные реакции. Две из них имеют особое значение для эи периментов с рекомбинантными ДНК это 3 ->5 - и 5 ->3 -экзонуклеазные реакции. В обоих случаях образуются продукты с 5 -фосфо-моноэфирными концами. Две указанные экзонуклеазные активности присуши разным участкам молекулы ДНК-полимеразы I, которые можно разделить, обработав белок протеолитическими ферментами. После разделения обнаруживается, что 3 —>5 -экзонук11еазная и полимеразная активности связаны с большим по размеру полипептидом, содержащим карбоксильную фуппу на конце, а5 ->3 -экзонуклеазнаяактивность-со вторым, более мелким фрагментом. [c.222]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология