Денатурация гомологичные

Опыты по гибридизации позволили исследовать гомологичность нуклеиновых кислот из разных источников. Вначале молекулы расщепляют (например, с помощью ультразвука) на фрагменты длиной 1000 нуклеотидов и подвергают денатурации. Фрагменты денатурированной ДНК смешивают с денатурированной ДНК из другого источника. Участки ДНК разных видов, имеющие близкие нуклеотидные последовательности, в той или иной степени гибридизуются, тогда как участки с сильно различающимися последовательностями гибридизации не поддаются. Рассмотрим один из вариантов постановки таких экспериментов. Денатурированную ДНК определенного организма, не подвергавшуюся деградации, заключают в агаровый гель [90] или наносят на нитроцеллюлозный фильтр [91]. Фрагменты ДНК из другого источника пропускают через колонку с ДНК-содержащим агаром или через фильтр с абсорбированной ДНК. Комплементарное спаривание соответствующих фрагментов задерживает их на колонке или фильтре, тогда как фрагменты, не нашедшие себе партнеров , свободно проходят дальше. [c.143]

ДНК/ДНК-гибридизация гомологичные последовательности нуклеотидов в ДНК разных видов. Как мы уже говорили, при нагревании изолированной ДНК две полинуклеотидные цепи расходятся в результате разрыва водородных связей. Такая денатурация (или плавление ), приводящая к образованию одиночных цепей, обратима при очень медленном охлаждении препарата будет происходить спаривание и реассоциация комплементарных участков. Если смешать короткие фрагменты денатурированных ДНК, полученных из двух различных, но близких между собой видов бактерий, при температуре выше точки их плавления и затем медленно охладить смесь, тоже будет происходить реассоциация. Двойные спирали, образовавшиеся из одиночных цепей ДНК двух разных организмов, называют гетеродуплексными молекулами. Для того чтобы в эксперименте можно было проследить за образованием гетеродуплексов, нужно, конечно, пометить ДНК одной из бактерий тяжелым или радиоактивным изотопом. [c.41]

Выделение. Одии из первых этапов выделения Б,-получение соответствующих органелл (рибосом, митохондрий, ядер, цитоплазматич. мембраны) с помощью дифференциального центрифугирования. Далее Ь переводят в растворимое состояние путем экстракции буферными р-рами солей и детергентов, иногда-неполярными р-рителями. Затем применяют фракционное осаждение неорг. солями [обычно (N 14)2804], этанолом, ацетоном или путем изменения pH, ионной силы, т-ры. Для предотвращения денатурации работу проводят при пониж. т-ре (ок. 4°С) с целью исключения протеолиза используют ингибиторы протеаз, нек-рые Б. стабилизируют полиоламн, иапр. глицерином. Дальнейшую очистку проводят по схемам, специально разработанным для отдельных Б. илн группы гомологичных Б. Наиб, распространенные методы разделения-гель-про-никающая хроматография, ионообменная и адсорбц. хроматография эффективные методы-жидкостная хроматография высокого разрешения и аффинная хроматография. [c.250]

Так как при денатурации нуклеиновых кислот их первичная структура сохраняется, то данный процесс может иметь обратимый характер. На способности нуклеиновых кислот восстанавливать свою нативную конформацию после денатурации (ренативация) основан чрезвычайно важный метод определения степени гомологичности, или родственности, нуклеиновых кислот. Этот метод называют молекулярной гибридизацией. Сущность этого метода (рис. 8.15) сводится к следующему сначала смешиваются растворы ДНК, вьщеленных из организмов разного вида (например, лягушки и кролика) затем эти растворы нагревают (для денатурации ДНК), а потом охлаждают. При этом возникают двухспиральные структуры разного состава наряду с двухспиральными молекулами, идентичными исходным ДНК, могут образовываться гибридные ДНК, содер- [c.283]

Более тонкий метод оценки генетического сходства организмов — метод гибридизации их ДНК, позволяющий количественно оценивать степень гомологичности ДНК этих организмов. В основе его лежит способность денатурированной (одноцепочечной) ДНК в подходящих условиях ренатурироваться, т. е. соединяться с комплементарной нитью с образованием двухцепочечной молекулы ДНК. Для этого ДНК, выделенную из организмов одного вида, денатурируют нагреванием и в таком виде фиксируют в каком-нибудь носителе, например в геле. Из другого вида организмов приготавливают меченую ДНК, подвергают ее денатурации и деградации на отдельные более или меиее мелкие фрагменты, после чего создают условия для реассоциации с ДНК, закрепленной в носителе. Количество двухцепочечной ДНК, образованной в результате взаимодействия однонитевых ДНК из разных организмов, служит мерой сходства этих организмов. (Количество образовав [c.138]

В 1985 г. был описан принципиально новый метод, позволяющий в миллион раз амплифицировать интересующие последовательности в препарате геномной ДНК,— полимеразная цепная реакция, ПЦР [21—23]. Идея метода и ее воплощение очень просты (рис. 6, А). Сначала синтезируются два дезоксиолиго-нуклеотида длиной 20—30 оснований, представляющие собой концевые последовательности интересующего фрагмента ДНК. Полярность выбрана так, чтобы после отжига их направления были обращены друг к другу. Избыточные количества этих олигонуклеотидов смешивают с геномной ДНК, и смесь нагревают для денатурации последней. Снижение температуры приводит к реассоциации олигонуклеотидов с гомологичными участками геномной ДНК. Затем проводят наращивание цепи при [c.138]

Гибридизацию по Саузерну [7] используют для выявления и изучения организации последовательностей ДНК после их разделения с помощью гель-электрофореза. Процедура гибридизации подразделяется на два этапа. Первый этап — перенос разделенных фрагментов ДНК на нитроцеллюлозную мембрану, осуществляемый под действием капиллярных сил (в последнее время применяется электроперенос) таким образом, чтобы относительное положение каждой молекулы ДНК осталось неизменным. Второй этап — гибридизация связанной ДНК с пробами, меченными изотопами (комплементарной ДНК), для выявления определенных последовательностей ДНК. Анализ ДНК по Саузерну включает в себя апуриниза-дию, денатурацию и нейтрализацию ДНК внутри геля с последующим переносом и связыванием нуклеиновой кислоты с мембраной. Далее мембрану инкубируют с одноцепочечной пробой, меченной радиоактивным изотопом, а после отмывания — выявляют гибридизовавшиеся гомологичные фрагменты ДНК путем авторадиографии с использованием рентгеновской пленки. [c.277]

Для выявления конкретных последовательностей нуклеотидов в клонотеках генов рекомбинантные бактерии или фаги рас-севают на чашках Петри и образовавшиеся колонии или бляшки переносят на нитроцеллюлозные или нейлоновые фильтры [235, 236]. Для этого стерильные фильтры накладывают на поверхность чашек, в результате чего часть бактериальных клеток или фаговых частиц прочно связывается с поверхностью фильтров. Расположение их на фильтрах и поверхности чашек Петри точно совпадает. Бактериальные клетки или фаговые частицы, сорбированные на фильтрах, лизируют щелочью, что сопровождается одновременной денатурацией заключенной в них ДНК. Освободившуюся ДНК фиксируют на фильтрах и гибридизуют с меченым олигонуклеотидным зондом, последовательность нуклеотидов которого точно соответствует последовательности нуклеотидов искомой ДНК. В результате гибридизации происходит специфическое прочное связывание зонда с идентичными и/или гомологичными последовательностями нуклеотидов в ДНК, содержащейся в отдельных бактериальных колониях или бляшках. [c.163]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология