Важнейшие методы определения ферментов

До недавнего времени мало было известно о локализации генов в хромосомах человека. Исключение составляли лишь признаки, сцепленные с полом (гл. 1, разд. В, 4), которые могут быть локализованы в Х-хромосомах. Ряд исследований, проведенных в последнее время, ознаменовались успехами и привели к систематическому картированию большого количества генов человека [169—171]. Наиболее важным оказался при этом метод слияния соматических клеток (дополнение 15-Д). Для слияния человеческих лимфоцитов с клетками грызунов часто используют инактивированный вирус Сендай, обладающий способностью вызывать сначала адгезию, а затем слияние клеток. Из гибридных клеток, полученных в результате слияния человеческих клеток с клетками мыши или хомяка, можно получить линии клеток, ядра в которых также сливаются. Хотя такие клетки могут размножаться, давая много поколений, тем не менее они склонны утрачивать при этом хромосомы, особенно те из них, которые ведут свое происхождение от клеток человека. Наблюдая за утратой определенных биохимических признаков, например некоторых ферментов, специфических для человека (которые могут быть отделены от ферментов хомяка методом электрофореза), можно установить наличие или отсутствие определенного гена в данной хромосоме. Очевидно, что для этого необходимо одновременно следить за потней хромосом на каждой стадии эксперимента. Новые методы окрашивания позволяют идентифицировать каждую из 26 пар хромосом человека. В настоящее время разрабатываются методы точного генетического картирования применительно к культуре клеток [171]. [c.268]

Биологически важным методом определения ферментативной активности и ее специфичности в гистохимической системе является изучение свойств фермента, проводимое на изолированной ткани. Здесь имеется две [c.175]

Функционально-ориентированный дизайн решает задачу синтеза соединений, которые должны обладать набором четко определенных, заранее заданных свойств. Здесь конечная цель состоит в оптимизации структуры целевого соединения с тем, чтобы добиться максимальной эффективности в выполнении им требуемой функции. Это могут быть такие важные физические свойства, как электропроводность (создание органических металлов) или способность образовывать жидкие кристаллы химические свойства, как, например, каталитическая активность, подобная активности биологических катализаторов (ферментов), или просто определенная реакционная способность, отвечающая тем или иным нуждам синтеза биологическая активность, в конечном счете направленная на лечение определенных болезней или на борьбу с насекомыми-вредителями. Здесь снова можно сказать, что все это — наиболее обычные задачи, с которыми органическая химия имела дело уже в течение столетия, задолго до появления термина молекулярный дизайн . Однако традиционный поиск полезных соединений ранее шел в основном методом проб и ошибок, а потому поглощал огромное количество труда и времени на синтез тысяч аналогов, необходимых для нахождения одного из них, отвечающего поставленной задаче. В настоящее время ясно обнаруживается тенденция двигаться в этой области гораздо более экономными путями. Достаточно часто еще в нача.те подобных проектов теперь применяют разнообразные методы молекулярного моделирования, позволяющее с разумной вероятностью установить тот набор структурных параметров, наличие которых должно обеспечить целевому соединению способность выполнять заданную функцию. Результаты первоначальных экспериментов используют далее для корректировки ис- [c.368]

Именно при изучении влияния микроокружения на специфические взаимодействия важную роль начинает играть метод аффинной хроматографии. Как подробно показано в гл. 4, возможно, напри.мер, использовать колонку с иммобилизованным ингибитором н вытеснять специфически сорбируемый фермент растворами его ингибиторов в различных концентрациях. Па основе объемов элюата могут быть рассчитаны константы диссоциации фермента как со связанным, так и с растворенным ингибитором. Если использовать тот же ингибитор для связывания на нерастворимой подложке и для элюирования специфически сорбированного фермента, то информацию о влиянии окружения на образование комплекса можно получить, основываясь на различиях, если таковые имеются, в величинах определяемых констант диссоциации. Поскольку специфические взаимодействия играют очень важную роль в большинстве процессов, протекающих в природе, разработка простого метода определения констант диссоциации комплексов несомненно имеет важное значение. [c.12]

Вполне уместно завершить эту книгу разделом о кристаллизации ферментов, поскольку получение кристаллов част представляет собой конечную стадию очистки и изучения фермента. Часть этого раздела следовало бы поместить в гл. 3,, потому что кристаллизация как метод осаждения—это очень-хороший и часто используемый способ очистки ферментов. Но-все же более уместно обсудить его в общих чертах в этом разделе. Кристаллизация играет важную роль в научных исследованиях по меньшей мере четырех типов она используется -1) как метод очистки ферментов, 2) для подтверждения гомогенности ферментных препаратов, 3) как метод стабилизации ферментов при хранении и 4) для определения третичной структуры ферментов методом рентгеноструктурного анализа. [c.332]

Исключительно важное значение химия поверхности адсорбентов и носителей имеет в газовой и жидкостной хроматографии для анализа сложных смесей, препаративного выделения чистых веществ и управления технологическими процессами. Химия поверхности играет важную роль и в процессах, протекающих в биологических системах. К ним относится, в частности, взаимодействие биологически активных веществ, в том числе лекарственных препаратов, с рецепторами — местами их фиксации в организме. Изучение модифицирования поверхности необходимо для решения вопросов совместимости искусственных материалов с биологическими. Химическое модифицирование адсорбентов применяется при разработке эффективных методов вывода из крови разного рода токсинов (гемосорбция). Прививка к поверхности крупнопористых адсорбентов и носителей соединений с определенными химическими свойствами необходима для иммобилизации ферментов, их хроматографического выделения и очистки, а также для иммобилизации клеток. Иммобилизованные ферменты и клетки эффективно используются в промышленном биокатализе, обеспечивая высокую избирательность сложных реакций в мягких условиях. Очистка и концентрирование вирусов гриппа, ящура, клещевого энцефалита и других для получения эффективных вакцин требует применения крупнопористых адсорбентов с химически модифицированной поверхностью. [c.6]

Необходимо, впрочем, отметить, что в настоящее время разработаны также специальные оптические методы определения некоторых ферментов, позволяющие судить об абсолютном количестве фермента в той или иной вытяжке или ткани. Наиболее важными из них являются спектрофотометрические методы, основанные на измерении степени поглощения растворами фермента лучей света с определенной длиной волны (стр. 66). [c.132]

Фиг. 23. Логарифмические графики рН-функций, иллюстрирующие методы определения рК для каталитически важных ионогенных группировок фермента, субстрата и фермент-субстратного комплекса [6].

В связи с этим необычайно важно понять, как работают ферменты. В этой главе мы попытаемся охарактеризовать ферментативный катализ с точки зрения химика-органика. Установление механизма действия определенного фермента сводится, таким образом, к проблеме определения механизма органической реакции и может, в принципе, исследоваться методами физической органической химии. Это предполагает знание структур субстратов и продуктов рассматриваемой реакции. Детальная структурная инфор- [c.449]

К настоящему времени накоплен огромный материал по структуре комплексов фермент — субстрат. Роль отдельных групп в отборе субстрата или в каталитическом акте, гипотетически вытекающая из этих структур, сегодня во многих случаях подтверждается сайт-направленным мутагенезом, одним из важнейших методов выявления роли отдельных аминокислотных остатков в функционировании белка (см. 7.11). Это позволяет заменить определенный аминокислотный остаток, предположительно участвующий в узнавании или в каталитическом акте, на любой другой путем создания соответствующей мутации в гене, программирующем исследуемый фермент или апофермент. Сохранение или, наоборот, исчезновение каталитических свойств является доводом в пользу или против роли данного остатка в каталитическом процессе. Однако сегодня установлены структуры ничтожно малой части ферментов и апоферментов и можно думать, что дальнейшее накопление материала по этому вопросу послужит основой для новых интересных обобщений. [c.223]

Определение кислотности казеина имеет большое значение для> установления качества продукта. Кислотность в нем создается продуктами распада и есть результат действия главным образом ферментов. Для установления количества этих продуктов можно пользоваться различной методикой. Для этой цели годна нефелометрия, методы определения аминного азота, определение сухого остатка в вытяжке, определение числа основности путем титрования кислотой. По стандарту установлен метод определения числа Тернера, но описание методики в стандарте усложнено и пропущена одна важная деталь. Усложнение касается промывки на фильтре с доведением общего объема фильтрата до 200 см . Стандарт, вводя промывку фильтра, стремится как бы к более тщательному извлечению веществ, определяющих кислотность, а на деле путем разбавления фильтрата и оставления без учета воды, оставшейся на фильтре, только снижает полученный результат и усложняет операцию. Коллоидный раствор фильтруется крайне медленно, и в силу большего коэфициента (80), на который множится полученный результат, ошибка опыта увеличивается. Серьезная деталь, пропущенная в стандарте, касается необходимости определенным образом измельчать казеин. Когда при определении кислотности из казеина извлекаются коллоиды, необходимо Считаться с поверхностью исследуемого продукта, так как извлечение касается только поверхнссти. Ниже приводятся цифры градусов Тернера, полученные при анализе одного и того же казеина, но различной степени измельчания [c.105]

Попадание паратиона в организм теплокровного животного может осуществляться через рот, дыхательные пути и кожу, а также через слизистые оболочки. Паратион, проникший в организм [323], проявляет себя как сильнейший яд для ферментов. Лучше всего исследовано его ингибирующее действие на холинэстеразы. Эти ферменты управляют в организме, например в нервных клетках теплокровных (и насекомых), жизненно важными процессами. Блокирование холинэстеразы паратионом и другими фосфорорганическими инсектицидами настолько характерно, что для контроля лиц, работающих с паратионом или другими инсектицидными соединениями фосфора, применяют аналитический метод определения холинэстераз-ной активности в крови людей [46, 151, 257]. Для судебного доказательства интоксикации паратионом и аналогично действующими инсектицидами также используют определение холинэстеразной активности [931]. [c.63]

Важным доказательством того, что процесс угнетения соответствует кинетике первого порядка, служит независимость степени торможения от концентрации фермента. Это важно с практической, точки зрения, так как концентрацию фермента трудно определить, и ее величины значительно различаются в зависимости от метода определения (так, при манометрическом определении получаются низкие значения, а при электрометрическом — высокие). Несмотря на эти различия, все методики должны давать одинаковые величины константы скорости. [c.100]

Методы, рассмотренные в этом разделе, позволили разработать важный способ определения концентрации фермента. В общем случае задача по определению точной молярной концентрации [c.220]

ПОДХОДЯЩИЙ адсорбент для своего фермента. В некоторых случаях, особенно когда фермент имеет необычный субстрат и составляет только часть общего белка, присутствующего в смеси, не возникает вопроса о целесообразности применения этого метода, если найден соответствующий адсорбент. Описаны примеры одноэтапной 1000-кратной очистки ферментов почти со 100%-ным выходом. Простота и легкость осуществления этой процедуры создали возможность выделения большего числа важных ферментов, встречающихся в малых количествах. НО даже в сказке с хорошим концом бывает много тщетных усилий и хотя бы одна неудача. Основная проблема заключается в низкой емкости адсорбентов, хотя использование более новых методов связывания лигандов улучшает этот показатель и уменьшает неспецифическую адсорбцию (в результате специфическая емкость адсорбента по отношению к данному ферменту может снизиться еще больше). Однако, как мы видели, неспецифические взаимодействия являются неизбежным злом, если нужно адсорбировать определенный фермент поэтому, чтобы добиться идеальных условий, необходимо методом проб и ошибок тщательно подбирать соответствующие адсорбент и буфер. [c.159]

Изучение свойств ферментов, разработка методов определения активности ферментов и, наконец, получение ферментов в чистом виде окончательно опровергли виталистические представления о ферментах, что создало широкие перспективы для развития ферментологии. Вместе с этим удалось выявить специфические особенности ферментов как биологических катализаторов, отличающие их от обычных катализаторов, являющихся чаще всего неор1 аническими веществами и иногда несложными по своей структуре органическими соединениями. Специфические особенности ферментов определяются их белковой природой. Коллоидальное состояние, большая чувствительность к изменениям температуры и разрушение при 80° и выше, строгая зависимость активности ферментов от концентрации водородных ионов отличают ферменты от обычных катализаторов, не относящихся к белкам. Однако самыми замечательными свойствами, характерными для биологических катализаторов — ферментов, является специфичность их действия и чрезвычайно высокая активность. Эти свойства позволяют считать ферменты идеальными катализаторами, играющими важную роль в процессах обмена веществ, лежащих в основе жизнедеятельности организмов. [c.176]

При периодическом способе определения активности фермент инкубируют с его субстратом в течение определенного периода времени, и затем реакцию останавливают каким-либо образом. Измеряют количество образовавшегося продукта исходя из предположения, что скорость реакции изменялась линейно в течение всего периода инкубации начиная с нулевого времени. Первое, что нужно проверить при использовании периодического метода, это предположение о линейности. Одна точка может дать заниженное значение начальной стационарной скорости реакции, если к тому времени, когда реакция была остановлена, ее скорость уже снизилась (рис. 8.4). С другой стороны, наличие лаг-периода в ходе ферментативной реакции также даст заниженное значение скорости, если ее определение основано на данных одного измерения. Чтобы проверить линейность изменения скорости реакции, необходимо провести серию инкубаций в течение разных периодов времени. Это особенно важно в случае использования неочищенных экстрактов тканей, так как при этом возможны многие побочные реакции. В результате продукт ферментативной реакции, который пытаются определить, может подвергнуться превращению под действием другого, следующего в метаболической цепи фермента. Более подробное обсуждение методов определения ферментативной активности в сырых тканевых экстрактах приводится в работе [167]. [c.287]

Определение изофермента КК-МВ креатинкиназы (АТР креатин-М-фосфотрансферазы, КФ 2.7.3.2) принято считать наиболее чувствительным способом выявления поражений миокарда (Galen, 1975, 1978 Lott, Stang, 1980). В силу того что обнаружение этого фермента очень важно для клиники, было разработано множество методик его определения. Тщательно изучали иммунохимические свойства изоферментов креатинкиназы и возможности создания на их основе диагностических методов определения содержания КК-МВ, отличающихся высокой специфичностью, которая характерна для процессов взаимодействия антиген — антитело. [c.326]

При выделении фермента наибольшая часть времени затрачивается на определения активности (и белка). Поэтому при выборе соответствующих тестов ищут таких, которые могут обеспечить максимальную скорость анализов. В этих случаях быстрота определений более важна, чем их высокая точность (основные методы определения ферментативной активности рассматривались в гл. 3). Количество белка можно установить различными путями на основании химических, физико-химических и даже чисто физических способов, но чаще всего его определяют а) сжиганием вещества и определением азота но Кьельдалю б) биуретовой реакцией в) по методу Лоури, совместным использованием биу-ретового и фенольного реактивов. [c.139]

Хотя АТР и является специфической мишенью, исторически важный метод определения АТР с помошью люциферазы не пригоден для биосенсорных приложений из-за его сложности. С помощью описываемых ниже гораздо более гибких хемилюми-несцентных систем гораздо легче достичь высокой чувствительности. Тем не менее довольно успешно используют люциферазу, иммобилизованную совместно с другими аналитически важными ферментами [И]. Этот метод позволяет определять на уровне 1 фмоль клинически важный (при заболеваниях сердца) фермент креатинкиназу. Если же еще добавить автоматизированные проточные системы, то можно получить довольно практичные сенсорные устройства [25, 59]. [c.490]

Особенно специфичен ферментативный гидролиз полисахаридов. Ферменты, каталитически ускоряющие гидролиз полисахаридов (носящие общее название карбогидраз), действуют строго избирательно, например только на а-гли-козидную связь (а-гликозидазы) или только на р-гликозидную связь (р-глико-зидазы). Избирательность действия карбогидраз зависит также от ряда других, более тонких особенностей структуры полисахарида. Так, например, некоторые ферменты вызывают гидролиз только тех гликозидных связей, которые находятся на определенном по счету месте от конца полигликозидной цепи (известны карбогидразы, гидролизующие каждую вторую гликозидную связь, каждую пятую или каждую шестую гликозидную связь). В связи с избирательным действием карбогидраз ферментативный гидролиз полисахаридов является важным методом изучения их строения. [c.677]

Недавние исследования динамики молекулы лизоцима с помощью кристаллографических методов показали [55, 56], что атомные смещения в белке наиболее выражены в области активного центра фермента. Хотя эти исследования иока носят лишь постановочный характер, не исключено, что в будущем применение рентгеноструктурного анализа именно для изучения динамических свойств молекул белка (определение средних амплитуд смещения каждого атома от его усреднеппой позиции в кристалле), помимо зарекомендовавших себя исследований статических свойств белковых молекул в кристалле (оиределение усредненных координат всех атомов в молекуле на основе соответствующего распределения электронных плотностей), может дать важную и принципиально новую информацию о структуре ферментов н механизмах их действия. Далее, обещающими являются новые возможности прямого рентгеиоструктурного анализа промежуточных состояний в ферментативном катализе путем охлаждения кристаллов фер-мент-субстратного комплекса в подходящих водноорганических растворителях и определепия структуры образующихся молекулярных комплексов непосредственно в ходе реакции [57, 58]. Этот [c.158]

Лленадо и Речниц [643] и Гуссейн [644] описали два быстрых метода определения роданезы, играющей важную роль в процессах жизнедеятельности животных. Согласно предложенной указанными авторами методике, скорость катализируемой ферментом реакции при контролируемых условиях определяется с помощью цианид-селективных мембранных электродов. [c.209]

Сульфгидрильная функциональная группа белков играет, как известно, важную роль в механизмах функционирования определенных ферментов. Поскольку большинство этих ферментов содержит несколько 5Н-групп, идентифицировать именно ту сульфгидрильную группу, которая непосредственно осуществляет каталитическую функцию, и определить ее место в аминокислотной цепи — довольно трудная задача. В некоторых благоприятных случаях каталитически активная 5Н-группа оказывается также наиболее химически активной, что может быть обусловлено ее незащищенным положением в третичной структуре фермента или ее окружением. Добавление одного эквивалента реагента на 5Н-группу, меченного радиоактивным изотопом, должно привести к тому, что помстится интересующая нас ЗН-группа. Однако 5Н-группа в активном центре может обладать такой же или меньшей реакционной способностью по сравнению с другими 5Н-групнами, и ее удается пометить лишь при помощи какого-нибудь остроумного метода. Если 5Н-груп-па, непосредственно участвующая в каталитическом акте, защищена субстратом от алкилирующих агентов, то после предварительного алкилирования всех остальных 5Н-групп в присутствии субстрата и последующего удаления избытка немеченого алкилирующего агента и субстрата ее можно пометить алкилирующим соединением, содержащим радиоактивную алки-лирующую группу. Этот прием используют только с нативным ферментом, поскольку добавление денатурирующего агента приводит к изменению укладки полипептидной цепи и нарушению специфической конформации активного центра, в результате чего субстрат не в состоянии защитить каталитически активную 5Н-группу, Алкилирующими агентами, удобными для проведения такого рода экспериментов, оказал ись С-иодацетамид и [c.479]

Примером Ф. м. а. ингибиторов является ультрамикрометод определения фосфорорганич. инсектицидов, основанный на способности последних необратимо ингибировать активность холинэстераз. Измеряя активность фермента в отсутствие и в присутствии ингибитора и пользуясь калибровочным графиком зависимости степени подавления активности от концентрации анализируемого вещества, можно определить ничтожное его количество. Так, чувствительность метода определения диэтил-га-нитрофенплтио-фосфата (после предварительного окисления) и диэтил-тг-нитрофенилфосфата составляет ок. 0,015 мкг. Микрометоды определения этих и других инсектицидов в воде и пищевых продуктах имеют особо важное значение в связи с их высокой токсичностью для человека и животных. [c.206]

Важнейшим методом изучения структуры активного центра является отравление фермента специфическими ядами. Существует набор ядов направленного действия, с помощью которых необратимо выводятся из строя определенные группы ферментов. Так, СО, H N, ]ЧаМз и МагЗ присоединяются к железу гема и поэтому являются ядами для дыхательных ферментов. Сульфгидрильные группы связываются необратимо с соединениями кадмия или ртути например, могут быть количественно оттитрованы нарахлормер-курибензоатом [c.148]

В этой связп следует упомянуть опыты некоторых биохимиков (П. Элоди), показавших, что ряд важных ферментов гликолиза — альдолаза, дегидрогеназа фосфоглицерпнового альдегида — усиливают свое действие при добавлении в среду некоторых неводных растворителей (диметилформамида), специфически воздействующих на третичную структуру белков (см. стр. 81). Этот результат показывает, что изучение ферментативного катализа в водных растворах может и не вскрыть максимальной потенции фермента как катализатора определенной реакции. При всем том изучение кинетики ферментативной реакции является наиболее общим методом исследования ферментов. [c.155]

Важным методом изучения активного центра явилась реакция фосфоглюкомутазы с диизопропилфторфосфатом (ДФФ) — необратимым ингибитором фосфоглюкомутазной реакции. Этот ингибитор присоединяется к гидроксильной группе серина, находящегося в активном центре фермента. Образующееся производное с трудом подвергается гидролизу и после триптического гидролиза фермента фосфори-лированный остаток серина может быть обнаружен в одном из образующихся пептидных фрагментов. Определение последовательности аминокислот такого фрагмента привело к расшифровке структуры активного центра фосфоглюкомутазы, которая оказалась следующей тре — ала — сер — гис — асп —. [c.173]

В клиническом анализе чрезвычайно важны методы селективного определения органических соединений в биологических жидкостях, например в крови. В большинстве случаев органические соединения можно определять с помощью спектро-фотометрии и каких-либо специфических катализируемых ферментами реакций. Соответствующие методики, однако, часто сложны и трудоемки и требуют значительного времени. В этом отношении от таких методик выгодно отличаются электрохимические сенсоры на основе иммобилизованных катализаторов. Действительно, ферментный сенсор обладает великолепной чувствительностью по отношению к биологическому субстрату с его помощью можно определять конкретные соединения непосредственно в сложных смесях без предварительного разделения [1,2]. Для того чтобы ферментный сенсор с успехом можно было применягь в медицине, он должен быть достаточно миниатюрным. Миниатюризация сенсоров в сочетании с их высокой селективностью достигается путем использования полупроводниковых устройств и иммобилизованных ферментов. [c.375]

Хотя из литературных данных известно, что изучались различные химические методы определения С-концевых аминокислот [206], ни один из этих методов не обнаружил достаточно удовлетворительных результатов, которые давали бы основание к его широкому использованию. Поэтому наибольшее распространение получил способ, основанный не на химической, а на ферментативной реакции с карбоксипептидазой — ферментом, реагирующим лишь с теми пептидами, которые содержат свободную карбоксильную группу. Поскольку рассмотрение ферментативных реакций выходит за рамки настоящего раздела книги, реакция с карбоксипептидазой в данном изложении не описывается. Следует отметить, однако, что проблема развития химии белка настолько важна, что вполне оправданы постоянно продолжающиеся исследования, направленные на поиск и разработку удобных и с широкими возможностями применения химических методов. Было показано, что для установления последовательности аминокислот с С-конца белковой молекулы по крайней мере ограниченное применение могут найти три разных химических метода, так как они дают результаты, подтверждающие данные, получающиеся при использовании карбоксипептидазы. Речь идет о гидразинолизе, этерификации с последующим восстановлением сложноэфирной группы на конце молекулы в спиртовую, а также о реакции с неорганическим тиоци-анатом. [c.376]

Под непрерывными методами определения ферментативной актиБности подразумеваются такие методы, которые позволяют непрерывно следить за ходом реакции, начиная от нулевого времени и до ее завершения, причем обычно производится мгновенная регистрация данных. Есть довольно большая группа ферментов, у которых образование продукта реакции или убыль субстрата можно наблюдать непосредственно вследствие того, что существует различие в спектре поглощения между продуктом и субстратом. Кроме того, суммарным результатом реакции может быть образование кислоты или основания, изменение вязкости или даже выделение тепла. Эти явления также можно регистрировать непосредственно. К важнейшим ферментам этого типа относятся дегидрогеназы, использующие NAD или NADP, многие гидролазы, расщепляющие синтетические [c.294]

Важную информацию о строении активного центра фермента можно получить с помощью метода двухкомпонентного обратимого ингибирования [8]. Для этого необходимо ввести понятие о взаимонезависимых и взаимозависимых ингибиторах. По определению, взаимонезависи-мые ингибиторы могут одновременно (и независимо) связываться с активным центром фермента, в то время как для взаимозависимых ингибиторов это исключено. [c.227]