ДНК метод последовательной гибридизации

Очевидно, недостаточно полная информация, которую дает даже комплекс всех доступных исследователю фенотипических свойств, приводит к необходимости подкреплять характеристику по физиологическим и другим свойствам бактерий данными о структуре их ДНК. Поскольку ДНК представляет собой наследственный материал клетки, можно полагать, что подобный подход наиболее надежно способствует приближению к естественной классификации бактерий. Однако изучение нуклеотидного состава ДНК явилось лишь самым начальным этапом в упорядочении систематики бактерий на основе строения генома. Для ее дальнейшего усовершенствования необходимо более глубокое изучение строения ДНК и в частности нуклеотидной последовательности. О сходстве нуклеотидных последовательностей ДНК дает возможность судить метод молекулярной гибридизации ДНК, уже нашедший достаточно широкое применение в современных исследованиях. [c.79]

III. Определение степени гомологии последовательностей ДНК с помощью методов молекулярной гибридизации [c.133]

Число последовательностей неповторяющейся ДНК, представленных в виде РНК, может быть определено непосредственно как доля ДНК, способной гибридизоваться с РНК. При гибридизации небольшого количества одноцепочечной ДНК с большим количеством РНК все последовательности ДНК, комплементарные РНК, вступят в реакцию с образованием гибрида РНК-ДНК. Такой метод называется методом насыщающей гибридизации, поскольку его основной признак-наличие избытка РНК, достаточно большого для того, чтобы каждая присутствующая комплементарная последовательность ДНК вступила в гибридизацию. Основной параметр такой реакции, определяемой концентрацией РНК,-произведение концентрации РНК на время, называемое Этот параметр в точности аналогичен величине используемой для описания реакций, определяемых концентрацией ДНК. [c.232]

Методы генетической трансформации позволяют не только вводить новый генетический материал в культурные растения, но также идентифицировать и изучать последовательности нуклеотидов, контролирующие экспрессию генов. При разработке любого проекта по генетической инженерии для получения контролируемой экспрессии в нужных тканях на соответствующей стадии жизненного цикла следует обращать самое серьезное внимание па манипуляции с изучаемыми генами. Выделение генов, обладающих высоким уровнем экспрессии в определенных органах различных растений на известной стадии жизненного цикла, значительно облегчает идентификацию промоторов, специфически активных в этих тканях и органах, а также позволяет проводить фундаментальные исследования экспрессии генов в онтогенезе. Таким образом, определены и используются в настоящее время для получения трансгенных растений нуклеотидные последовательности, которые усиливают или подавляют экспрессию генов в зависимости от воздействий окружающей среды (например, света или стресса). В данной главе описываются некоторые основные свойства генов растений, и, кроме того, изложены некоторые подходы к изучению организаций перенесенных генов методом блоттинг-гибридизации по Саузерну (разд. 6.2) и экспрессии генов в трансгенных растениях. [c.304]

Если полосы не соответствуют ни одному из приведенных выше критериев, скорее всего онн состоят из перестроенных фрагментов и их анализ методом блоттинг-гибридизации по-Саузерну может оказаться затруднительным. Для дальнейшего изучения такие полосы можно одновременно расщепить двумя рестриктазами, кроме того, использовать короткие-специфические пробы и рестриктазы, узнающие последовательности из четырех нуклеотидов. Если результат и в этом случае трудно интерпретировать, то эти последовательности следует клонировать и определить в них порядок нуклеотидов. [c.316]

Зонды для скрининга геномной библиотеки можно получить по крайней мере двумя способами. Во-первых, можно использовать клонированную ДНК близкородственного организма (гетерологичный зонд). В этом случае условия гибридизации нужно подбирать таким образом, чтобы она могла происходить при существенном расхождении между нуклеотидными последовательностями зонда и искомой ДНК это позволяет решить проблемы, связанные с заведомым различием между ДНК - источником зонда и исследуемой ДНК. Во-вторых, зонд можно получить методом химического синтеза, основываясь на известной аминокислотной последовательности белкового продукта искомого гена. [c.67]

Любой эффективный диагностический тест должен быть 1) высокоспецифичным в отношении молекулы-мишени 2) достаточно чувствительным для выявления небольших количеств мишени 3) достаточно простым, позволяющим без труда получать однозначные результаты. Существуют два типа методов молекулярной диагностики один основан на сродстве антитела к конкретному антигену, другой - на идентификации специфических нуклеотидных последовательностей с помощью гибридизации или ПЦР. [c.201]

Высокочувствительным и специфичным методом обнаружения нуклеотидных последовательностей в биологических образцах является гибридизация. Его использовали при разработке способов идентификации патогенных микроорганизмов в клинических образцах и различных микроорганизмов в окружающей среде. [c.201]

Наиболее простым способом гибридизации является проведение ее с образцом, нанесенным в виде пятна на некоторую подложку (дот-гибридизация, от англ. dot — пятно). Этот тип гибридизации фактически уже описывался на примере анализа на содержание гена энтеротоксина, Разрешающая сила метода повышается, если анализируемый образец предварительно подвергнуть гель-электрофорезу. В этом случае полезно перенести материал с геля на более удобный для проведения гибридизации материал, приведя гель в контакт с целлюлозным или нейлоновым фильтром. Добавление меченых зондов позволяет обнаружить полосы, несущие определяемые последовательности. Этот метод известен как гибридизация по ay зерну. [c.263]

Привязка индивидуальных транскриптов (клонов кДНК или экспрессированных последовательностей-мишеней) к хромосомным районам с помошью метода флуоресцентной гибридизации in situ, ПЦР и т.д. [c.561]

Анализ ДНК методом блот-гибридизации используется не только при скрининге кДНК и геномных библиотек, но и для анализа геномной ДНК. При помощи этого метода можно определить присутствие определенной последовательности ДНК в геноме (например, присутствие чужеродного гена в геноме трансгенных растений, копийность гена, анализировать изменения в нуклеотидной последовательности гена и т. д.). Анализ ДНК методом блот-гибридизации основан на идентификации определенных фрагментов ДНК путем их гибридизации со специфическими мечеными зондами. Он состоит из следующих этапов 1) рестрикция ДНК 2) перенос рестрицированных фрагментов из геля на нейлоновый фильтр и их иммобилизация 3) гибридизация с меченым зондом. [c.47]

Оценки общего числа экспрессирующихся генов, полученные методом насыщающей гибридизации и кинетическим методом, обычно хорошо согласуются. Кинетический метод дает более низкие значения (поскольку некоторые, очень редкие последовательности могут не вступать в гибридизацию.) Метод насыщающей гибридизации дает более высокие значения (поскольку в гибридизации всегда могут участвовать некоторые последовательности, присутствующие в количестве более одной копии на геном). Поэтому для яйцеводов птиц кинетическим методом обнаруживают около 13 ООО видов мРНК, в то время как методом насыщающей гибридизации-15000 видов. [c.234]

Как осуществляют селекцию определенного клона геномной ДНК из библиотеки Один из методов называется гибридизацией колоний. Последовательность операций этого метода приведена на рис. 19.8. Бактериальные колонии, несунще химерные векторы, лизируют на нитроцеллюлозных фильтрах. Затем их ДНК денатурируют и фиксируют на фильтре. Фильтр гибридизуют с радиоактивным зондом (обычно это клонированная кДНК), соответствующим интересующей исследователя последовательности. Все колонии, с которыми гибридизуется зонд, при авторадиографии выявляются в виде темных пятен. После этого соответствующие химерные векторы могут быть выделены из исходной библиотеки. [c.244]

ДНК-зонды, содержащие последовательности искомых генов, дают возможность идентифицировать эти гены, даже если они и не экспрессируются. Это можно сделать с помощью таких методов, как гибридизация в растворе (достаточно устаревший подход), гибридизация по Саузерну и гибридизация in situ. [c.291]

Рис. 36.10. Метод прогулка по хромосоме . Пусть необходимо обнаружить ген X в рамках протяженного фрагмента ДНК. Точное положение гена неизвестно, однако имеется первичный зонд ( ), соответствующий некоему участку генома (показан в данном случае на 5 -конце исследуемого фрагмента ДНК). Кроме того, имеется библиотека перекрывающихся фрагментов генома. (Для упрощения на рисунке изображены только пять фрагментов.) Первичный зонд гибриди-зуется только с клонами, содержащими фрагмент 1. Этот фрагмент можно использовать далее в качестве зонда для выявления фрагмента 2. Процедура последовательной гибридизации повторяется вплоть до обнаружения фрагмента 4, который гибридизуется с фрагментом 5, содержащим искомый ген X.

Однако существуют ограничения для использования метода прямой гибридизации 1) если различия в последовательностях оснований двух РНК становятся значительными, и они широко распространены в пределах молекул, гибриды нестабильны и могут расщепляться РНКазой. Например, если имеет место 50% гомология последовательности оснований для двух РНК, распределение изменений может быть, как показано на рис. 17 в верхней части (А) непарность оснований одинаково распределена по всей длине молекулы. В этом случае защита от действия РНКазы будет незначительной. В нижней части (Б) гомологичные последовательности сгруппированы в нескольких полностью сохранившихся областях. В этом случае защита будет действительно равной 50%. Ситуация, подобная последней модели, правильна для сегментов РНК, кодирующих НА и NA. Остаточная запщта от действия РНКазы для гибридных молекул между подтипами — около 30 и 20% соответственно — существует вследствие наличия высококонсервативных областей, как было показано по профилям плавления. Таким образом, мутации, приводящие к заменам аминокислот, летальны в этих областях, в то время как в изменчивых областях допустимы многие мутации [105]. В большинстве случаев, когда защита от РНКазы гибридов РНК относительно низкая, техника дает результаты, которые не дооценивают [c.100]

Несмотря на то что в течение нескольких десятилетий предпринимались попытки получить штаммы вируса гриппа, адаптированные к человеческому организму сериями пассажей на чужеродных для хозяина клеточных системах, результаты этих опытов были весьма вариабельными [7]. Кроме того, даже когда наблюдали нарушение адаптации к человеческому организму, было невозможно определить генетические основы изменения фенотипа. Подобно этому до сих пор не уточнены мутации, необходимые для адаптации к человеческому организму вирусов, обитающих не в человеческой популяции [26]. К настоящему времени ймоют-ся лишь крайне ограниченные сведения о специфических мутациях в отдельных генах, влияющих на адаптацию к определенным хозяевам. В этом отношении определенный интерес представляет недавнее выделение и изучение вируса H7N7 при диссеминированной смертельной гриппозной эпизоотии у тюленей. С помощью метода конкурентной гибридизации было найдено, что каждый из 8 сегментов РНК этого вируса был очень близок к эквивалентным сегментам других птичьих вирусов. Однако было обнаружено, что вирус лучше размножался в организме млекопитающих, чем птиц [61]. Хотя такое изменение вида хозяев может быть связано с определенным набором генов птичьего вируса, также вполне возможно, что адаптация - была обусловлена серией последовательных мутаций. [c.309]

Для идентификации бактерий иногда используют также метод ДНК-зондов (генных зондов), являющийся разновидностью метода молекулярной гибридизации ДНК—ДНК. Реакция гибридизации ведется в этом случае не между двумя препаратами тотальной ДНК, а между фрагментом нуклеотидной последовательности ДНК (зондом), включающим ген (генетический маркер), ответственный за какую-то определенную функцию (например, устойчивость к какому-нибудь антибиотику), и ДНК изучаемой бактерии. Самым распространенным способом создания генных зондов является выделение специфических фрагментов путем молекулярного клонирования. Для этого вначале создают банк генов изучаемой бактерии расщеплением ее ДНК эндонуклеазами рестрикции, а затем отбирают нужный клон из суммы фрагментов ДНК методом электрофореза с последующей проверкой генетических свойств этих фрагментов методом трансформации. Далее выбранный фрагмент ДНК с помощью фермента лигазы вводят в состав подходящей плазмиды (вектора), а эту комбинированную-плазмиду вводят в удобный для работы штамм бактерий (например, Es heri hia соН). Из биомассы бактерии, несущей ДНК-зонд, выделяют плазмидную ДНК и метят ее, например, радиоизотопной меткой. Затем осуществляют гибридизацию ДНК зонда с ДНК бактерии. Образовавшиеся гибридные участки проявляют методом ауторадиографии. По относительной частоте гибридизации генетического маркера с хромосомой той или иной бактерии делают заключение о генетическом родстве этих бактерий с исследуемым штаммом. [c.197]

Новые своеобразные методы отдаленной гибридизации и селекции разработал И. В. Мичурин. Следует отметить, что всю свою деятельиость он стремился направить на решение практических задач садоводства. Свои теоретические взгляды Мичурин изложил в труде Принцип и метод работы . В самом начале своей деятельности на огромном материале по акклиматизации растений Мичурин убедился в несостоятельности ламарковских представлений об адекватной изменчивости растений под влиянием внешней среды. Мичурин создал свой принцип получения новых сортов. В этой работе он установил такую последовательность посев, отбор, гибридизация и, наконец, наиболее ответственный этап — отбор гибридных сеянцев. Селекционеры нередко сталкиваются с трудностью скрещивания растений при отдаленной гибридизации. Чтобы преодолеть это затруднение, Мичурин разработал способ вегетативного сближения между назначенными к скрещиванию растениями. Используя этот метод, Мичурин добился скрещивания яблони с грушей, яблони с рябиной и получил многие другие комбинации. Во многих случаях с целью сохранения качеств гибридов Мичурин не размножал их семенами, а пользовался вегетативным способом. [c.282]

При обобщении знаний учащихся о структуре веществ весьма эффективно использование наложений графопособий для характеристики геометрии и пространственного строения молекул (например, молекул фтороводорода и воды, воды и аммиака, аммиака и метана). При изучении типов гибридизации электронных орбиталей метод наложения позволяет проследить последовательность изменения энергий связей, форм электронных облаков, величин валентных углов и т. д., что обеспечивает более целенаправленное понимание теоретических вопросов. Новые возможности открывают прием, обратный наложению,— снятие транспарантов, что позволяет выделить детали, укрупнить их, освободив фон от других частей изображения. Так, в обучении химии снятие дает возможность выделить формулы веществ в уравнениях реакций, тепловые эффекты реакций, показать закономерность изменения свойств, физических констант и т. д. [c.130]

Некоторые формальные характеристики эукариотического генома. могут быть получены с помощью NteioaoB гибридизации нуклеиновых кислот, разработанных в 60-х годах. Эти методы прежде всего позватяют получить суммарную валовую характеристику степени разнообразия последовательностей ДНК, образующих геном.. Мож- [c.186]

Следующий после создания библиотеки этап -это поиск клона (клонов), несущего искомую последовательность ДНК. Для этого используют три широко известных метода гибридизацию с меченым ДНК-зондом с последующим радиоав-тографическим анализом, иммунологический скрининг и скрининг по активности белка, кодируемого геном-мишенью. [c.64]

Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ПЦР-амплификации Более простой и быстрый метод получения больших количеств мутантных генов, альтернативный системе с использованием фага М13, -сайт-специфический мутагенез в сочетании с полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Один из вариантов этого подхода состоит в следующем. Ген-мишень встраивают в плазмидный вектор (рис. 8.4) и помещают препарат в две пробирки. В каждую из них добавляют по два специфических праймера для ПЦР 1 и 2 в одну пробирку, 3 и 4 - в другую. Праймеры 2 и 3 полностью комплементарны одному из участков клонированного гена или прилегающей к нему последовательности, а 1 и 3 комплементарны другому участку, но содержат один некомплементарный нуклеотид и гибридизуются с разными цепями, так что в результате происходит замена обоих нуклеотидов данной пары. Положение сайтов гибридизации праймеров 1 и 2 в одной пробирке и 3 и 4 - в другой таково, что ПЦР-продукты в разных пробирках имеют разные концы. По окончании ПЦР содержимое пробирок объединяют и проводят денатурацию, а затем ренатура-цию. Поскольку концы амплифицированных молекул ДНК из двух пробирок неодинаковы, одноцепочечные ДНК из разных пробирок ассоциируют с образованием кольцевьгх молекул с [c.163]

Зонды получают разными способами. Один из них состоит в следующем. ДНК патогенного микроорганизма расщепляют с помощью рестрицирующей эндонуклеазы и клонируют в плазмидном векторе. Затем проводят скрининг рекомбинантных плазмид с использованием геномной ДНК как патогенного, так и непатогенного штаммов. Те плазмиды, которые содержат последовательности, гибридизующиеся только с ДНК патогенного штамма, составляют основу видоспецифичных зондов. После этого проводят ряд дополнительных гибридизаций с ДНК, выделенными из различных организмов, чтобы удостовериться, что потенциальные зонды не дают с ними перекрестной гибридизации. Для определения чувствительности метода каждый из зондов проверяют также на модельных образцах, в том числе и на смешанных культурах. [c.188]

Этот метод заключается в том, что после лизиса клеток хозяина ДНК различных клонов, фиксированную например, на нитроцеллюлозном фильтре, после удаления сопутствующих белков подвергают термообработке, в ходе которой происходит отжиг — раскручивание двунитевых молекул и образование клубков однонитевых ДНК. То же самое продельшают с меченой ДНК-зондом. Если теперь обработать препаратом однонитевой ДНК-зонда раскрученные ДНК клонов при медленном охлаждении, то может произойти образование гибридных двунитевых молекул — гибридазация — и включение метки в фиксированный препарат ДНК. Для образования гибридных молекул достаточно комплементарности последовательностей обеих ДНК из 15-20 нуклеотидов. Вероятность случайного совпадения такого числа комплементарных оснований (или еще более длинных фрагментов ДНК) в неродственных молекулах ДНК ничтожна. Поэтому гибридизация является чрезвычайно селективным и надежным тестом на присутствие родственной молекулы ДНК. [c.106]

Более тонкий метод оценки генетического сходства организ-м ов — сравнение нуклеотидных последовательностей ДНК из раз-н ых источников методом ДНК—ДНК-гибридизации. Метод наи-<5олее полезен для классификации на уровне вида, т.е. в случае I высокой степени гомологии, и мало информативен для классификации объектов на уровне высоких таксонов . В то же время часто несовпадение выводов, сделанных на основании фенотипических признаков и ДНК-гибридизации. В целом значение данных о строении ДНК для систематики прокариот офомно, так как позволяет перейти от установления степени сходства к выводам о степени родства между организмами. [c.160]

В специализированных лабораториях вирулентность культур определяют на экспериментальных животных и методами генодиагностики. Для выявления энтеротоксина (холерогена) кроликов-сосунков весом около 150 г после лапаротомии заражают внутри-кишечно дозами 10 и 10 микробных клеток (по двое животных). Через 48 ч исследуют погибших (или забитых) животных, отмечая патологоанатомические признаки интоксикации расширение кишки, инъекции сосудов, кровоизлияния и т.п. В ходе генодиагностики у культур выявляют нуклеотидные последовательности гена токсина (vet). Для этого применяют соответствующие ДНК-зонды (ДНК-ДНК гибридизация на нитроцеллюлозных фильтрах) или ПЦР со специфическими праймерами. [c.169]

Экспресс-диагностика. В качестве экспресс-диагностики используются молекулярно-биологические методы выявление в клинических образцах нуклеиновых кислот возбудителя с помощью ПЦР и метод гибридизации на основе ДНК-зондов. Разработана мультиплексная ПЦР, позволяющая одновременно определять в клинических образцах нуклеотидные последовательности М. genitalium, и. urealyti um и М. hominis. Однако в связи с высокой частотой носительства полученные результаты требуют подтверждения методами серодиагностики. [c.252]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология