Гибридные клетки способы получения

Традиционные методы генетического анализа, разработанные Менделем, основаны на переходе из диплоидного состояния в гаплоидное в процессе мейоза. Восстановление диплоидности происходит при оплодотворении. Изменения плоидности обеспечивают сегрегацию генов, то есть их распределение в потомстве. Несколько десятилетий назад было показано, что соматические клетки эукариот можно размножать in vitro, т.е. поддерживать в виде так называемых клеточных культур (рис. 18.1). У этих культивируемых in vitro клеток в норме не происходит смены диплоидной и гаплоидной фаз. Тем не менее существуют различные способы, позволяющие изучать определенные генетические феномены на культурах клеток. Существенным преимуществом клеточных культур является то, что возникновение новой клеточной генерации занимает несколько часов, тогда как появление нового поколения на уровне целой особи-это месяцы или годы. Дополнительное преимущество для изучения генетики человека-это возможность комбинировать наследственные детерминанты клеток в культуре, поскольку проведение направленных скрещиваний между людьми, естественно, невозможно. Недавно были разработаны способы получения гибридных клеток, содержащих наследственную информацию различных видов организма, например человека и мыши. Такие гибриды нельзя получить другими способами, т.е. на уровне целых организмов. [c.290]

Принципиально новый шаг в решении этой проблемы был сделан после того, как был предложен способ получения моноклональных антител (Г. Кёлер, К. Мильштейн, 1975) (рис. 17). В ответ на введение антигена в организме мыши активируются продуцирующие антитела В-клетки. Эти клетки могут жить только в организме хозяина и при их переводе в искусственную культуральную среду быстро гибнут. Однако если слить иммунную клетку с опухолевой (миеломные лимфоциты, которые способны неограниченно долго жить в искусственной среде), то в результате образуются гибридные клетки, унаследовавшие свойства своих предшественников, так как они способны долго жить в искусственных условиях и одновременно синтезировать антитела. Такие клетки получили название гибридом . С помощью специальных методов на особых ростовых средах можно отобрать отдельные клетки, синтезирующие только один тип антител. Такие клетки помещают в культуральную жидкость, в которой они размножаются и образуют много родственных ( клон ), синтезирующих большое количество антител, получивших название моноклональных. Моноклональные антитела — это антитела, однородные по своей структуре и специфичности, которые можно производить в неограниченных количествах. [c.105]

Метод генетической инженерии позволяет также заменить многие методы, основанные на получении продуктов in vivo, на способы получения этих продуктов in vitro. До последнего времени диагностические, лечебные и профилактические сыворотки получали из крови иммунизированных лошадей или вакцинированных людей-доноров. В настоящее время этот дорогой и непростой способ вытесняется гибридомной техникой получения антител. Эта техника основана на получении клеток-гибридом путем слияния В-лимфоцитов, взятых от иммунизированных животных и миеломных (раковых) клеток. Образующаяся гибридная клетка (гибридома) обладает способностью миеломной клетки быстро размножаться на искусственных питательных средах [c.104]

Имеются два общих подхода к осуществлению внутриклеточной экспрессии клонированных генов. Соответствующий ген может быть клонирован в одной рамке считывания с синтетическими или бактериальными кодирующими последовательностями и экспрессироваться с образованием гибридного белка. Другой способ — непосредственная экспрессия встроенного гена. Потребность в экспрессии эукариотических полипептидов в составе гибридных белков возникла, когда было обнаружено, что уровень экспрессии эукариотических белков в клетках Е. oli ограничивается по той причине, что они распознаются клеткой как чужеродные и разрушаются [9]. Это особенно наглядно проявилось в случае полипептидов небольшого размера. При сшивании эукариотического гена с бактериальным синтезировались гибридные продукты, которые накапливались в клетке в значительно больших количествах [10, 11]. Однако, если требуется получить эукариотический полипептид в чистом виде, возникает необходимость в методе, позволяющем правильно расщепить гибридный белок. С другой стороны, непосредственная экспрессия одного эукариотического гена дает возможность получить нужный белковый продукт. Однако первичные продукты трансляции несут на своем Ы-конце остаток метионина. В клетках Е. соН имеются ферменты, осуществляющие при необходимости эффективное отщепление метионина от природных белков однако в случае рекомбинантных белков эти ферменты работают не столь эффективно [1]. Таким образом, белки, полученные в результате прямой экспрессии эукариотического гена, могут содержать несвойственный природному белку N-концевой метионин. [c.98]

Если гены, клонированные в векторе %, экспрессируются в клетках Е. oli и могут комплементировать генетический дефект клетки-хозяина, то содержащие их фаги можно отобрать из всего пула гибридов. Такой тест на комплементацию можно проводить двумя основными способами. Первый из них заключается в том, что образуют лизогенную бактерию с гибридным фагом. После этого проверяют способность полученной лизогенной бактерии расти на селективных средах. Однако у многих векторов Х удалены гены, нужные для лизогенизации. В этом случае можно использовать фаг-помощник для образования двойных лизогенов. Второй метод отбора определенных гибридов фага Л заключается в литической комплементации. Обычно фаг Л неспособен размножаться в такой клетке, которая не может расти из-за какого-нибудь генетического дефекта. Однако если инфицирующий фаг вносит в клетку такой ген, который комплемен-тирует дефект клетки-хозяина, то клетка оказывается способной расти и поддерживать размножение этого фага. В конечном счете заразивщий фаг убьет клетку и образуется блящка. [c.42]

Первой стадией при создании гибридных моноклональных антител является получение обычной гибридомы, синтезирующей моноклональные антитела желаемой специфичности к одному из двух антигенов. Затем гибридому адаптируют к росту в присутствии 8-азогуанина и отбирают те клетки, которые способны размножаться на НАТ-среде. Эти первичные гибридомы, выступающие в роли миеломного партнера, подвергают слиянию с иммунными лимфоцитами мышей, иммунизированных вторым антигеном. В результате слияния и отбора получают дочерние (вторичные) гибридомы, способные синтезировать антитела двойной специфичности. Таким способом были получены гибридные моноклональные антитела, которые одновременно связывались с кислой фосфатазой простаты человека и поверхностным антигеном гепатита В. Гибридные антитела оказались стабильными в процессе хранения, не изменяли своей двойственной специфичности и обладали достаточно высокими константами связывания по отношению к обоим антигенам. Гибридные антитела, взаимодействующие с пероксидазой и соматотропи-ном, были успешно использованы для изучения локализации сома-тотропина в клетке. [c.166]

Разные представители почвенных и водных грамотрицательных бактерий проявляют огромное многообразие метаболических активностей, которые не только представляют значительный научный интерес, но и потенциально важны для биотехнологии. Однако ряд этих активностей нельзя воспроизвести в клетках Е. соИ, несущих в составе гибридных молекул ДНК соответствующие генетические детерминанты, так как метаболические и физиологические возможности этой бактерии ограничены. Кроме того, исследования последних лет показали, что, несмотря на фундаментальную схожесть организации генетического аппарата прокариот и способа реализации генетической информации, существуют характерные для каждой таксономической группы особенности, отличающие ее от других групп по тонким механизмам регуляции экспрессии генов. Это может приводить к тому, что гены бактерий одного семейства (рода) не будут экспрессироваться в клетках бактерий дрзтого семейства (рода) или обусловят очень низкий уровень продукции соответствующего белка. Поэтому для изучения экспрессии генов, получения суперпродуцентов с определенными свойствами и т. п. необходимо либо создавать для каждой таксономической группы бактерий специализированную векторную систему на основе плазмид и фагов [c.211]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология