Плазмиды pGl и pG карты

Рис. 21.7. Аденовирусный вектор. В клетку-хозяина, несущую интегрированный в геномную ДНК функциональный ген Е1 аденовируса, вводят встроенную в сегмент аденовирусного генома (0-17 единицы карты) плазмиду с терапевтическим геном (ТГ) и участок геномной ДНК аденовируса (9-100 единицы карты). Длина генома аденовируса равна 100 единицам. В результате рекомбинации (штриховая линия) между перекрывающимися участками плазмиды и ДНК аденовируса образуется молекула ДНК, эквивалентная полноразмерному вирусному геному. Рекомбинантная ДНК, содержащая терапевтический ген, упаковывается и высвобождается из клетки после лизиса. Образующиеся вирусные частицы дефектны по репликации. Плазмидная ДНК, входящая в состав конечной генетической конструкции, не влияет на упаковку рекомбинантной ДНК (не показано).

В связи с огромными объемами перерабатываемого материала выщелачивание проводят под открытым небом, а не в помещениях со строго контролируемыми условиями. Поэтому микроорганизмам приходится работать при разных погодных условиях, существенно различающемся насыщении минеральными солями и неодинаковых pH. Ни система в целом, ни рудное тело не бывают стерильными в них всегда присутствуют природные бактерии. Специально подобранные или мутантные штаммы выщелачивающих бактерий должны хорошо сочетаться с природной микрофлорой. Несомненно, что с помощью генетических манипуляций могут быть получены штаммы с повышенной способностью окислять железо или минералы, а также переносить высокие концентрации металлов или кислот. Работы в этом направлении ограничиваются неполнотой наших знаний обо всех интересующих нас микроорганизмах и о деталях механизма разложения сульфидных минералов кроме того, мы почти ничего не знаем о генетических особенностях выщелачивающих микроорганизмов (например, об их хромосомных картах, наличии и функциях плазмид, способности к трансформации или переносу плазмид). Здесь имеется широкое поле для исследований, очень важных с точки зрения биотехнологии. [c.204]

Рис. 17.3. Генетическая карта Ti-плазмиды (масштаб не соблюден). Т-ДНК содержит гены ауксина, цитокинина и опина, которые транскрибируются и транслируются только в растительных клетках. За пределами Т-ДНК находится кластер г/г-генов, ген(ы), кодирующий(е) фер-мент(ы) катаболизма опина, и сайт инициации репликации ori), которьш обеспечивает стабильное поддержание плазмиды в А. tumefa iens. Л и П - левая и правая фланкирующие последовательности соответственно.

После выявления рекомбинантных клонов, содержащих гены целлюлаз, проводят накопление рекомбинантной ДНК и составляют ее рестрикционную карту, идентифицируя положения различных сайтов рестрикции и путем делеционного анализа (получая дочерние плазмиды с вставками меньшг[ размера) уточняя положение и размер нужного гена [c.104]

Рис. 15.18. Генетическая карта плазмиды RP4, обусловливающей устойчивость к антибиотикам. В этой плазмиде были найдены две области, содержащие большой и малый фрагменты tra они ответственны за конъюгацию. Гены, кодирующие устойчивость к антибиотикам-ампициллину (Ар), тетрациклину (Тс) и ка-намицину (Km)-распределены по разным участкам плазмиды.

Впервые транспозоны были обнаружены, когда оказалось, что некоторые гены устойчивости к антибиотикам связаны с инфекционными факторами устойчивости. Общая структура факторов устойчивости изображена на рис. 8.13, Б. При исследовании гетеродуплексной ДНК, образованной ДНК F-фактора, и фактора устойчивости обнаружена гомология по всей области tra-генов, что свидетельствует об эволюционном родстве этих структур. Последовательность ДНК, кодирующая устойчивость к тетрациклину, tet, обрамлена элементами IS 3 и встроена в область гомологии фактора устойчивости и F-фактора. В негомологичной области карты локализованы гены, кодирующие резистентность к ампициллину (атр), сульфонамиду (sul), стрептомицину (str), хлорамфе-николу (ст[) и канамицину (кап). Эти гены устойчивости порознь или группами обрамлены IS элементами или другими инвертированными повторами (указаны стрелками на рис. 8.13, Б). Отдельные гены устойчивости например, tet или атр, могут переноситься в другие эписомы или плазмиды, а также в хромосомы фагов и бактерий, почему и возник термин транспозон. [c.244]

Рис. 9.11. Физическая карта клонирующей плазмиды pBR322. Эта плазмида сконструирована из трех частей. Участок начала репликации (оп )-из плазмиды рМВ1 ген tet-из плазмиды pS lOl, а ген атр-яз транспозона ТпЗ. Указаны соответствующие уникальные сайты рестрикции.

Космидные векторы — плазмиды, несущие os-последователь-ности, распознаваемые компонентами системы упаковки фага X [1], представляют собой удобный инструмент для клонирования и анализа больших фрагментов геномов, картирования хромосом и клонирования генов, размер которых превышает 20 т. п. н. Хотя в настоящее время разработаны приемы, позволяющие конструировать космидные клоны и оперировать с космидными библиотеками, все же неизбел но возникают трудности при получении и анализе больших библиотек, необходимых для клонирования генома млекопитающих в частности, вызывает затруднение введение специфических модификаций во вставки в тех случаях, когда их нельзя прямо увязать с характеристиками рестрикционной карты. Эти трудности могут быть весьма существенными. Во многих случаях для их преодоления используются методы генетики бактерий, позволяющие упростить илп облегчить решение этих задач. [c.74]

Рис. 31. Рестрикционная карта вектора широкого круга хозяев, сконструированного на основе плазмиды Н5Р1010 (по Ю. Д. Цыганкову и А. Ю. Чисто-сердову, 1986)

Выделено много вставок (включений, инсерций) Тп/6 , о которых известны лишь их положения на карте, но неизвестны те гены, которые мутировали в результате вставки транспозона. Большинство их выделено как вставки вблизи какого-нибудь исследуемого гена (см. эксперимент 2). Чтобы можно было обозначать вставки ТпЮ в соответствии с их положением на карте и тогда, когда остается неизвестным, в каком именно гене произошла вставка, сделанное ранее Хонгом и Эймсом (Hong, Ames, 1971) предложение было видоизменено. Все такие вставки обозначают символом из трех букв, который начинается с буквы г. Вторая и третья буквы символа обозначают приблизительное положение вставки на карте в минутах. Вторая буква обозначает тот сегмент длиной 10 мин, в который попадает вставка. Сегменты эти нумеруются по часовой стрелке от минуты О (а = 0—10, Ь=10—20, с = 20—30 и т. д.). Третья буква точно таким же образом обозначает уже минуты карты внутри этих сегментов длиной в 10 мин. Например, вставка ТпЮ, локализованная вблизи гена hisW между минутами 47 и 48 генетической карты, обозначается как zeh-754 ТпЮ вставка ТпЮ вблизи локуса his на 44-й минуте обозначается как zee-2 Тп/6 . Номера аллелей приписываются таким вставкам последовательно независимо от второй и третьей букв символа. Таким образом, если более точное картирование приведет к необходимости изменить трехбуквенный символ вставки, то номер вставки все равно не изменится. В соответствии с этим правилом используются обозначения от zaa до zjj. Для обозначения вставок во внехромосомных элементах мы используем буквы zz, за которыми следует буква, обозначающая внехромосомный элемент. Символом zzf обозначаются вставки в плазмиде F. [c.13]

Каждая группа использует по две случайные неохарактери-зованные вставки ТпЮ в хромосому Salmonella (полученные в эксперименте 1). Должно быть определено положение этих элементов Тп/0 на генетической карте и их ориентация. Идея заключается в том, чтобы встроить плазмиду (зТпЮ1ас+ в тот элемент Тп/0, который находится в хромосоме. Полученный в результате этого штамм Hfr скрещивают затем с различными реципиентами, определяя в результате точку начала его переноса и направление переноса. Таким образом, определяется локализация и ориентация последовательностей Тп/0 в хромосоме. [c.54]

Очень полезно, а иногда и просто необходимо иметь рестрикционную карту такой клонированной вставки ДНК. Расположение сайтов рестрикции, особенно тех, что встречаются лишь 1—2 раза во всей плазмиде, можно определить при помощи стандартных методик рестрикционного картирования [24]. Для обоих типов одноцепочечных зондов необходимо иметь единичный сайт рестрикции в участке тестируемой ДНК, дистальном по отношению к сайту связывания с РНК-полимеразой в случае РНК-зондов (см. разд. 5.1) или с олигонуклеотидами в случае ДНК-зондов (см. разд. 6.3 и рис. 10). После реассоциации одноцепочечного меченого ДНК-зонда с тестируемой ДНК может возникнуть необходимость расщепить гибридную последовательность ДНК на 2—3 фрагмента с оптимальной для ДГГЭ длиной. В этом случае надо использовать сайты рестрикции, имеющиеся в тестируемом фрагменте. [c.141]

Кольцевая структура генома. Оказалось, что различные штаммы Hfr переносят гены в клетки-реципиенты в неодинаковой последовательности. Сопоставление этих последовательностей показало, что все они согласуются с единой круговой генетической картой. Кольцевая структура генома Е. соИ была подтверждена в исследованиях Дж. Кэйрнса, получившего радиоавтографы ее реплицирующейся хромосомы (рис. 9.4). Единая кольцевая молекула генома Е. соИ содержит около 4000 тыс. п. н. Она может дополнительно включать F-фактор, имеющий кольцевую форму и состоящий из 60 тыс. п. н., а также другие плазмиды, профаги и иные необязательные элементы. [c.204]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология