Вестерн-блоттинг, определение NPT

Рис. 36.5. Блоттинг-перенос. По методу Саузерна тотальную ДНК, выделенную из культуры клеток или ткани, обрабатывают одной или несколькими рестриктазами и полученную смесь фрагментов подвергают электрофорезу в агарозном или полиакриламидном геле. ДНК, несущая отрицательный заряд, мигрирует к аноду. Небольшие фрагменты двигаются быстрее крупных. После окончания электрофореза разделенные фрагменты ДНК подвергают мягкой денатурации, инкубируя гель в растворе щелочи. На следующем этапе гель накладывают на нитроцеллюлозный фильтр. Фрагменты ДНК переносят на нитроцеллюлозу с помощью методических приемов, разработанных Саузерном, и фиксируют полученную нитроцеллюлозную реплику тепловой обработкой. Далее реплику инкубируют с меченым кДНК-зондом, гибридизую-щимся с соответствующим комплементарным фрагментом ДНК на нитроцеллюлозном фильтре. После интенсивной промывки фильтр помещают на рентгеновскую пленку. Фиксируемые на радиоавтографе сигналы соответствуют расположению фрагментов ДНК, комплементарных последовательности зонда. Метод Нозерн-блот (для анализа РНК) принципиально не отличается от метода переноса по Саузерну (Саузерн-блог анализа). Тотальную РНК подвергают электрофорезу. Сама процедура переноса РНК из геля на фильтр несколько отличается от метода Саузерна, поскольку молекулы РНК менее стабильны, чем молекулы ДНК. Метод Вестерн-блот применяется для выявления определенных белков с помощью

Иммунный комплекс. Продукт реакции антиген-антитело, который может также содержать в своем составе компоненты системы комплемента. Иммуноблоттинг (вестерн-блоттинг). Метод идентификации белков и определения их свойств с использованием антител. [c.558]

Определение NPT-11 методом вестерн-блоттинга [c.357]

ИЭФ определяют число дуг преципитации со стандартной смесью антигенов и сравнивают с контрольной антисывороткой (рис. 2.10). Двумерный ИЭФ аналогично ИЭФ (рис. 2.7). Вестерн-блоттинг сравнивают профиль связывания исследуемой и нормальной сывороток со стандартным антигеном. Используют маркеры мол. массы для определения специфичности антител (см. гл. 6). [c.95]

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ЭПАГ) стал повседневной процедурой для определения компонентов сложных молекулярных смесей. Электрофоретический перенос полосы на нитро-целлюлозную мембрану (Вестерн-блоттинг) обеспечивает возможность не только тестирования специфичности антител, но и позволяет сконцентрировать макромолекулярный иммуноген для последующего введения его животным. Показано, что окрашенные на белок, вырезанные и тонко измельченные по- [c.52]

Наиболее простой путь для преодоления этой проблемы- предварительное разделение активностей NPT-II и АТРазы. Для этого разработан ряд методов, наиболее удобный из которых основан на фракционировании с помощью неденатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле [46]. Из исследуемого материала на холоду в присутствии смеси ингибиторов протеиназ готовят бесклеточные экстракты и фракционируют их методом электрофореза. Гель, содержащий фракционированный экстракт, вынимают из прибора и уравновещивают соответствующим буфером, который используют для проведения реакции. Фермент затем должен взаимодействовать с кофакторами и субстратами это достигается путем иммобилизации их в слое агарозы, плавящейся при низких температурах. На поверхность акриламидного геля наливают агарозу, и она застывает. Реакцию проводят, как и в обычной жидкой фазе, и образующийся в результате фосфорилированный канамицин переносится затем с геля на лист фосфоцеллюлозной бумаги посредством капиллярных сил, как при блоттинге по Саузерну. Бумагу затем npoj мывают, как описано выще, но в данном случае радиоактивный канамицин выявляют радиоавтографией. Судя по сообщениям, чувствительность данного метода позволяет в оптимальных условиях (чистый препарат фермента) обнаружить 1 нг активного фермента, но значительно снижается при использовании неочищенных препаратов. Известен и другой метод определения NPT-II с помощью специфических антител и вестерн-блоттинга (разд. 6.8). [c.347]

Метод выделения и электрофореза белков для вестерн-блоттинга аналогичен тому, который используют для определения активности NPT-II (разд. 6.7). Если необходимы количественные результаты, то в каждом образце следует определить концентрацию белка по Брэдфорду (приложение 61III]) и провести электрофорез, нанеся на каждую дорожку известное количество белка. В предварительных экспериментах с тотальными белковыми экстрактами количество белка, наносимого на гель, должно быть относительно велико — 500—1000 мкг на дорожку. Методика, приведенная здесь, начинается с того, что берут промытый полиакриламидный гель, содержащий разделенные белки. [c.361]

Фотографируют пель, используя фильтр Кодак 2Е Wratten . Чувствительность такого определения достаточно высока, чтобы обнаружить до 0,2 нг GUS это сравнимо с чувствительностью вестерн-блоттинга ). [c.373]

Молекулы, разделенные с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, можно электрофоретически перенести на нитроцеллюлозную мембрану, с которой они свяжутся, воспроизведя картину элекрофоретического разделения. Этот процесс называют Вестерн-блоттингом или электроблоттингом [10, 17]. После блоттинга треки стандартного антигена и маркеров мол. массы окрашивают белковым или углеводным красителем, а остальные. инкубируют с образцами антител 9, 18]. С помощью меченых антител выявляют отдельные антигенные полосы (после электрофореза в. восстанавливающих условиях — субъединицы сложных молекул антигенов). Эту стадию называют иммунохимическим окрашиванием. В полном варианте метода используют как исключительную способность электрофореза в ПААГ разделять молекулы, концентрации которых очень малы, так и свойство антител выявлять специфические антигенные компоненты. Таким образом, метод чаще всего применяют для определения состава и молекулярных размеров антигенов, но, кроме того, он очень эффективен для определения специфичности антител (в частности, МКА) и поиска антигенно родственных молекул в однотипных или раз-лич.ных антигенных препаратах (например, различные виды бактерий, вирусные мутанты, клеточные экстракты и т. д.). [c.230]

При демонстрации связывания МКА с репликой антигена необходимо быть уверенным в специфичности конъюгата. Каждое моноклональное антитело имеет определенный изотоп. Для окрашивания реплики можно применять антитела, реагирующие со всеми изотипами мышиных иммуноглобулинов, одиако такую специфичность следует подтвердить с помощью ELISA, используя для связывания с лунками паиели чистые препараты всех изотипов. Другой способ — проверить набор МКА всех изотипов с помощью Вестерн-блоттинга. [c.235]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология