Рестрикционные использование для картирования

Любой сегмент локуса w, полученный в таком клоне, может быть использован для выделения всего локуса с помощью метода прогулка по хромосоме , который представляет собой усовершенствованный вариант рестрикционного картирования. Он основан на использовании перекрывающихся фрагментов, полученных в результате разрывов генома в одной и той же области. Принцип метода иллюстрирует рис. 37.5. [c.477]

Клонирование ряда генов человека позволило обнаружить полиморфизм по этим генам на основе использования рестрикционного анализа хромосомной ДНК. Различающиеся фрагменты ДНК, соответствующие данному гену или его участкам, выявляются при помощи электрофореза рестриктов и последующей гибридизации их с радиоактивным зондом — клонированным участком ДНК, по которому изучают полиморфизм. Такие зонды используют также для локализации генов непосредственно на препаратах хромосом. Объединение этого подхода с методом дифференциальной окраски дает возможность привязывать конкретные гены к участкам конкретных хромосом. Объединение генеалогического метода с цитогенетическим, а также с новейшими методами генной инженерии значительно ускорило процедуру картирования генов у человека. Карты хромосом человека представлены на рис. 20.9. [c.507]

Использование перекрывающихся фрагментов-это ключ к рестрикционному картированию. Рассмотрим для примера уже известный нам фрагмент в 1900 п.н. Он образуется либо в результате обработки фрагмента А-2100 ферментом В, либо после обработки фрагмента В-2500 ферментом А. Из данных о расщеплении фрагментов А-2100 и В-2500 мы знаем, что с одной стороны на расстоянии 200 п.н. от фрагмента 1900 находится следующий А-сайт, а с другого конца, на расстоянии 600 п.н.,-следующий В-сайт. На основе этих данных мы можем нарисовать карту, указав на ней вертикальными линиями сайты рестрикции ферментами А и В и размеры фрагментов между ними. [c.45]

До сих пор мы рассматривали определение последовательностей в случае определенных, но коротких фрагментов ДНК. А как перейти к определению нуклеотидной последовательности длинных молекул Так же как и при рестрикционном картировании, метод состоит в использовании перекрывающихся фрагментов. Предположим, что у нас есть серия последовательных фрагментов, расположенных следующим образом [c.51]

Диабет И-это широко распространенное заболевание, которое проявляется в среднем возрасте и при старении, но обычно в мягкой форме. Генетические факторы здесь играют важную роль, о чем свидетельствует высокая степень конкордантности монозиготных близнецов. Природа генетических факторов и тип наследования еще не установлены. Результаты некоторых исследований с использованием рестрикционного картирования инсулинового гена говорят о том, что у больных диабетом II чаще обнаруживаются гипер-вариабельные участки в 5 -фланкирующей области в непосредственной близости к инсулиновому гену. Заметим, однако, что эти результаты еще не подтвердились. [c.295]

Вначале предполагали, что мРНК должна иметь такую же последовательность оснований, как ДНК, с которой она транскрибирована. Для доказательства того, что выделенная из генома последовательность ДНК действительно совпадала с последовательностью мРНК, использованной для ее выделения, их нуклеотидные последовательности сравнивали с помощью как электронной микроскопии, так и рестрикционного картирования. Но выявлены были как раз различия между их нуклеотидными последовательностями, заключающиеся в наличии дополнительных участков, присутствующих в ДНК генома, но отсутствующих в мРНК. [c.246]

При картировании с использованием нескольких рестриктаз могут быть получены результаты и того, и другого типа. Разрывы, вносимые одними ферментами, не попадают в промежуточную последовательность тогда длина соответствующих фрагментов увеличивается. При использовании других ферментов из той же промежуточной последовательности будут образовываться дополнительные фрагменты. Объединяя вместе эти данные, мы видим, что при создании полной рестрикционной карты гена, содержащего интроны, карта каждого конца гена соответствует карте каждого конца последовательности мРНК. Но в некоторой точке внутри гена карты различаются там имеется дополнительная область, содержащая ряд сайтов узнавания, отсутствующих в мРНК. Разрешающая способность метода рестрикционного картирования позволяет обнаруживать участки гена размером до 20-30 п. н. [c.249]

Оптимальное планирование Оиохими-ческих экспериментов по картированию. Построение физических карт на ЭВМ освобождает экспериментаторов от рутинной и трудоемкой работы и дает возможность получать подробные физические карты (порядка 10 сайтов по каждой рестрикта-эе), построение которых без помощи ЭВМ невозможно. Однако построение физических карт с 10-20 сайтами по каждой рестриктазе (при использовании только информации об одиночных и совместных рестрикциях) сталкивается с серьезньми вычислительньми трудностями даже на современных ЭВМ. В разделе 5.6 обсуждаются возможности дополнительных биохимических экспериментов, которые позволяют иногда обойти математические проблемы построения физических карт за счет получения (довольно трудоемкого) биохимическими методами информации о порядке расположения рестрикционных фрагментов (при использовании таких методов требования к точности определения длин фрагментов снижаются). Привлечение информации о дополнительных биохимических экспериментах дает возможность строить очень подробные физические карты (20-50 сайтов по каждой рестриктазе). Работа с ЭВМ в режиме диалога позволяет свести к минимуму и экспериментальную работу по картированию - при этом минимизируется количество электрофорезов и указывается минимальный набор дополнительных биохимических экспериментов, необходимых для построения физической карты. [c.161]

Все рестрикционные эндонуклеазы бактерий узнают специфические, довольно короткие последовательности ДНК и связываются с ними. Этот процесс сопровождается разрезанием либо в самом сайте узнавания, либо в каком-то другом, что определяется типом фермента. Подробно мы анализировали реакцию разрезания при обсуждении перспектив ее использования для картирования или реконструирования ДНК in vitro (гл. 3 и 19). Теперь мы рассмотрим вопрос о том, как выполняют эти ферменты свои природные функции. [c.432]

Рис. 18.17. Картирование клонированных генов человека при использовании гибридов соматических клеток мыши и человека с помощью блот-гибридизации по Саузерну. Присутствие хромосом человека определяется при цитологическом изучении гибридных клеток. Ферменты, служащие маркерами данных хромосом, выявляются с помощью гель-электрофореза. Рестрикционные фрагменты ДНК, выделенной из гибридной линии, разделяют электрофорезом в агарозном геле и переносят на нитроцеллюлозный фильтр. На этом фильтре проводят их гибридизацию с зондом, меченным радиоактивными изотопами. (По Shows ТВ. et al, 1982. Adv. Hum. Genet., 12, 341-452.)

Недавно сконструированы векторы, содержащие промоторы SP6, Т7 или ТЗ, непосредственно примыкающие к сайтам для клонирования ([8] и неопубликованные результаты). Это позволяет быстро и легко приготовить меченные згр РНК-зонды, специфичные в отношении концов клонированной ДНК и поэтому очень подходящие для использования в качестве зонде в для идентификации новых космид, вставки в которых перекрываются со вставкой в исходной космиде. Этот процесс выделения перекрывающихся клонов известен как прогулка по геному, причем использование промоторных систем SP6/T7/T3 может существенно уменьшить время и труд, затраченный на проведение такой прогулки , поскольку при этом отпадает необходимость в идентификации концов клонированных фрагментов с помощью рестрикционного картирования и физического выделения этих фрагментов для приготовления новых зондов. [c.65]

Полиморфизм ДНК. Для экспрессируемых продуктов генов, таких, как группы крови, белки тканей и крови, характерен высокий уровень полиморфизма, однако генетическая изменчивость, наблюдаемая на уровне ДНК, существенно выще. Поскольку значительная часть генома, вероятно, не принимает прямого участия в регуляции или кодировании продуктов генов, мутации в этих нерегуляторных и некодирующих участках ДНК не имеют фенотипического выражения и являются селективно нейтральными. Определение последовательностей нуклеотидов у различных индивидов и использование рестрикционных ферментов для картирования генома человека выявило необыкновенно высокую изменчивость на [c.288]

В этой главе мы подробно опишем методы, используемые нами в настоящее время для конструирования и скрининга космидных библиотек, а также для опытов типа прогулка вдоль хромосомы . Прогулка вдоль хромосомы определяется как метод, используемый для выделения фрагментов ДНК, соседних с данным районом клонированной ДНК. В большинстве случаев такая прогулка осуществляется с помощью скрининга геномных библиотек, полученных из частично гидролизованной ДНК, с использованием меченого уникального рестрикционного фрагмента, выделенного из концевой области клонированного района. Таким образом получают клоны, содержащие перекрывающиеся фрагменты ДНК, и после рестрикционного картирования и соответствующей ориентации фрагментов материал этих клонов может использоваться для продолжения такой прогулки . [c.17]

С целью выделения специфического зонда для прогулки вдоль хромосомы идентифицируют рестрикционный фрагмент, находящийся на конце вставки эукариотической ДНК. Такой фрагмент не должен содержать повторяющихся последовательностей ДНК- Это легко проверить путем гибридизации с суммарной ДНК мыши, используемой в качестве зонда для гибридизации по Саузерну. Этот зонд содержит космидную ДНК, гидролизованную различными ферментами (использованными для картирования). В нормальных условиях будут гибридизоваться лишь те рестрикционные фрагменты, которые содержат повторяющиеся последовательности ДНК (Steinmetz et al., 1980). Фрагменты, которые не гибридизуются и которые происходят из концевых областей вставки эукариотической ДНК, далее выделяют с помощью электрофореза в агарозном геле, используя один из многочисленных имеющихся методов (Maniatis et al.. [c.34]

Использование YA для получения клонотек нуклеотидных последовательностей. При создании искусственных хромосом дрожжей in vitro в среднем удается клонировать фрагменты ДНК длиной 300 т.п.о. Однако с помощью гомологичной рекомбинации, проводимой непосредственно в клетках дрожжей, можно получать вышеупомянутые вставки в несколько млн п.о. Для реализации полной емкости вектора используют предварительно полученные YA -конструкции, в которых клонированы частично перекрывающиеся последовательности. Для обнаружения перекрывающихся клонов используют рестрикционное картирование с гибридизацией по Саузерну, метод прогулки по хромосоме и ряд других стандартных методов исследования генома, которые будут рассмотрены во втором томе этой книги. После обнаружения таких перекрывающихся клонов проводят скрещивание гаплоидных клеток, содержащих требуемые YA , в полученных диплоидных штаммах индуцируют мейоз, при котором с высокой частотой возникают требуемые рекомбинантные YA с протяженными непрерывными последовательностями - контигами - исследуемого генома. Для предотвращения образования в результате рекомбинации дицент-рических и ацентрических YA , которые нестабильны, объединяемые вставки должны быть клонированы в одной и той же 5 3 -ориентации по отношению к маркерам вектора. После завершения клетками мейотических делений и споруляции в спорах обнаруживают требуемые рекомбинанты, конечная длина которых после проведения серии последовательных скрещиваний может превышать 2 млн п.о. [105, в]. [c.91]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология