Обратная транскриптаза использование в ПЦР

Использование обратной транскриптазы или химический синтез гена имеют преимущество над методом дробовика, поскольку получаемый при этом ген не является прерывистым . Прерывистые гены содержат один или несколько участ- [c.220]

С помощью обратной транскриптазы можно синтезировать копию любой части мРИК, выбрав для этого подходящий праймер. Эта возможность облегчает анализ строения какого-либо специфического участка гена. Но можно получить и набор генных фрагментов, если использовать в качестве праймеров произвольные олигонуклеотиды, получаемые, например, в результате гидролиза ДНК тимуса теленка панкреатической ДНКазой. Их разнообразие столь велико, что среди них имеются комплементарные последовательности к любому из участков мРИК (или ДНК). Добавление в реакционную смесь суммарной фракции таких праймеров дает возможность получить в наборе J HK копии всех участков анализируемого гена. Они полезны для использования их в качестве гибридизационных зондов, применяемых для поиска определенных клонов в банках генов (см. гл. 9). [c.182]

В последние годы были осуществлены биохимические (энзиматические) синтезы нескольких генов, в частности, кодирующих биосинтез белка глобина (В. А. Энгельгардт). Для этого был использован фермент обратная транскриптаза, осуществляющая синтез по схеме РНК-> --ДНК. [c.412]

По-видимому, многие считают, что наибольший вклад вирусологии в развитие науки и человеческой цивилизации вообще — это открытие обратной транскриптазы, использование которой лежит в основе современной генной инженерии. Однако следует иметь в виду, что большинство важнейших представлений современной молекулярной и клеточной биологии (например, об нитронах, сплайсинге или онкогенах) сформировалось именно в результате изучения структуры и функций вирусов. Несомненно, фронт вирусологических исследований будет и дальше расширяться, а число ученых, применяющих специфические методы вирусологии, будет постоянно возрастать. [c.7]

Использование обратной транскриптазы [c.217]

Теория соматического отбора предполагает передачу приобретенных соматических мутаций V-генов антител половым клеткам. Эта передача может осуществляться при участии обратной транскриптазы (копирование соматической РНК в ДНК) и эндогенных РНК-ретровирусов (продуцируемых лимфоцитами), действующих как генные челноки , перевозящие мутантные последовательности V-генов в половые клетки. После этого должна происходить интеграция возникшей в соматических клетках генетической информации в ДНК зародышевой линии и замещение ею ранее существовавшей ДНК-последовательности (рис. 1.2). Когда мы формулировали свою гипотезу, мы подчеркивали, что она — полезный эвристический инструмент , подобный использованным в теоретической физике. Наша теория обращает внимание исследователя на возможность наследования приобретенных признаков. Она убедительно показывает, что теоретически барьер Вейсмана легко преодолим, а, следовательно, он может быть преодолимым и в реальности. [c.150]

Для выделения и клонирования (размножения) гена чаще всего применяют полимеразную цепную реакцию (см. гл. 4). Еще один метод — синтез ДНК (гена) с использованием обратной транскриптазы. Напомним, что этот фермент есть в частицах некоторых РНК-содержащих вирусов. Обратная транскриптаза катализирует синтез ДНК, используя в качестве матрицы РНК [c.172]

Кислый аминополисахарид гепарин [М> 10 ООО) известен в качестве антикоагулянта крови. Кроме того, он применяется в биохимии как ингибитор рибонуклеаз. Это его качество, по-видимому-отражает некоторое сходство полимера, содержащего две-три суль, фогруппы на каждую дисахаридную структурную единицу, с РНК-Две эти особенности определили использование гепарина в качеств, лиганда для аффинной хроматографии факторов коагуляции крове и (особенно широко) для очистки белков, взаимодействующих и нуклеиновыми кислотами (полимераз, обратной транскриптазы, рес стриктаз, факторов инициации и элонгации белкового синтеза и др.). Кроме того, иммобилизованный гепарин связывает липопротеид-липазы и некоторые липопротеиды. Гепарин-агароза выпускается всеми упомянутыми фирмами-поставщиками аффинных сорбентов, кроме Bio-Rad . [c.370]

Сенжер и Коулсон создали метод анализа последовательности ДНК, который основан на ферментативном копировании однонитевых частиц ДНК [18]. Максам и Гилберт создали метод, в основу которого положена химическая модификация четырех оснований, входящих в состав ДНК, и который с одинаковым успехом применим как к однонитевым, так и к двунитевым молекулам ДНК [19]. Оба метода используют авторадиографическое определение згр-меченных олигонуклеотидов, которые разделяют в зависимости от их длины электрофорезом денатурированных фрагментов в полиакриламидном геле. На практике, успех этих методов во многом определяется недавними достижениями в энзимологии нуклеиновых кислот, особенно использованием ферментов рестрикции, расщепляющих молекулы ДНК, и обратной транскриптазы, с помощью которой получают циклические ДНК, комплиментарные РНК-матрице. Нижеследующее описание методики анализа будет, однако, предполагать наличие гомогенных образцов ДНК подходящей длины. [c.188]

Сенжеровский плюс и минус -метод обеспечивает получение информации о последовательности двумя взаимоподтверждающи-ми способами. Минус -процедура включает получение копий с одноцепочечной ДНК с использованием ДНК-зависимой полимеразы или с частиц РНК с применением обратной транскриптазы. [c.188]

Тремя главными матричными процессами, присущими всем без исключения живым организмам, являются репликация ДНК, транскрипция и трансляция. Репликация ДНК происходит с участием ферментов ДНК-полимераз. Роль матриц играют разделенные цепи двунитевой материнской ДНК. Субстратами являются дезоксирибонуклеозид-5 -трифосфаты. Транскрипция осуществляется с помощью ферментов РНК-полимераз. Матрицей служит одна из нитей двунитевой ДНК, а субстратами — рибонуклеозид-5 -трифосфаты. Трансляция происходит на рибосомах с участием информационной РНК (мРНК) в качестве матрицы и аминоз1Ц1л-тРНК в качестве субстратов. Кроме того, при заражении клеток вирусами, у которых наследственная информация содержится в молекулах вирусных РНК, в клетках начинается запрограммированный этими РНК синтез ферментов, называемых обычно РНК-репликазами, которые катализируют биосинтез РНК, используя в качестве матриц молекулы РНК. Некоторые вирусы, вызывающие злокачественные новообразования, содержат ферменты, катализирующие обратную транскрипцию — синтез ДНК с использованием в качестве матриц молекул РНК. Эти ферменты часто называют обратными транскриптазами или ревертазами. Более строгие названия двух последних групп ферментов соответственно — РНК-зависимая РНК-полимераза и РНК-зависимая ДНК полимераза. [c.174]

Получение генов. Их возможно получать методом химического синтеза, выделением из геномов живых организмов, а также при помоши обратной транскриптазы, которая на соответствующей мРНК кодирует комплементарную ДНК (кДНК). Первый и второй методы имеют ограниченное применение. Химический синтез — достаточно длительная и дорогостоящая процедура. Вьщеление однородных фрагментов ДНК осуществляется при помощи ферментов-рестриктаз, которые узнают и расщепляют ДНК в строго фиксированных точках. Эти ферменты функционально связаны с модифицирующими метилазами следующим образом метилазы осуществляют метилирование в сайтах ДНК, которые атакуются рестриктазами. Метилирование защищает собственную ДНК клетки от неспецифической фрагментации, в то время как чужеродная ДНК немедленно разрушается. В месте разрыва полинуклеотидных цепей образуются, в частности, липкие концы, способные образовывать между собой комплементарные пары оснований. Открытие В. Арбером рестрикции и использование ее для получения генов было отмечено Нобелевской премией. В настоящее время идентифицировано более 500 рестриктаз, причем их название складывается из первой буквы рода микроорганизма и двух пер- [c.499]

Рис. 147. Последовательность событий при использовании вирусной (вироидной) РНК в качестве вектора 1 — обратная транскриптаза, 2 — ДНК-полимераза, 3 — встраивание в плазмиду (клонирование), 4 — включение чужеродного гена, 5 — инфицирование растений, б — транскрибирование с образованием инфекционной РНК и последующее заражение расте-ния-хозяина.

Вирусные обратные транскриптазы, так же как все ДНК- и РНК-полимеразы, содержат ионы Zn . Они проявляют наибольшую активность при использовании в качестве матрицы РНК своего вируса, но способны синтезировать также ДНК, комплементарную к самым разным РНК. Обратным трапскриптазам необходима затравка синтез новой цепи ДНК они ведут в направлении 5 ->3 и вообще во многих отношениях напоминают ДНК-полимеразы. [c.921]

Совсем недавно была открыта обратная транскриптаза, что вызвало многочисленные дискуссии и даже недоумения, а уже сегодня этот фермент нашел совершенно неожиданное применение с помощью обратной транскриптазы при использовании в качестве матриц информационных РНК синтезировали in vitro ряд генов [14, 15]. [c.8]

В развитых странах каждый пятый человек умирает от рака, но вряд ли стоило бы только по этой причине посвящать ему здесь целую главу. Первое место по количеству вызываемых смертей занимают все-таки сердечно-сосудистые заболевания, да и многие другие болезни причиняют людям ничуть не меныпе вреда. Очень серьезную проблему для человечества представляют несбалансированное питание и инфекционные болезни. Важность изучения клеточной биологии рака в значительной мере обусловлена тем, что в основе родственных заболеваний, объединенных под этим названием, лежат нарушения наиболее фундаментальных законов поведения клеток в многоклеточном организме. Для того чтобы разобраться в сущности рака и разработать рациональные способы его лечения, необходимо понять как внутренние механизмы жизнедеятельности клеток, так и механизмы взаимодействия их друг с другом в тканях и организме в целом. Именно по этой причине фундаментальные исследования рака столь существенно обогатили наши знания о нормальных клетках. Ведь в ходе этих исследований были созданы эффективные методы, которые во многом определяли нынешнюю революцию в клеточной биологии. Достаточно назвать использование обратной транскриптазы из онкогенных РПК-содержащих вирусов и линий миеломных клеток (потомков раковых В-лимфоцитов) для получения соответственно кДПК (разд. 4.6.3) и моноклональных антител. Можно спорить о том, в какой степени огромные средства, брошенные на лабораторные исследования в этой области, способствовали выполнению основной задачи - развитию терапии рака, однако не подлежит сомнению, что стимулированный ими прогресс клеточной биологии значительно углубил наши знания в областях медицины, выходящих за пределы чистой онкологии. [c.445]

При использовании в качестве предшественника одного из нуклеотидов, меченного можно получить зонды с удельной радиоактивностью 10 распад./мин на 1 мкг в системе с обратной транскриптазой или 3-10 распад./мин на 1 мкг в системе ник-трансляции. Эти удельные активности пропорционально увеличиваются при использовании двух или трех меченых предшественников, но, когда используются все четыре предшественника, меченные происходит снижение активности обратной транскриптазы и системы ник-трансляции. При ник-трансляции с использованием 1-дезоксицитидина (уд. активность выше 1500 Ки/моль Amersham или NEN) без носителя удается в настоящее время получить зонды с удельной активностью 10 распад./мин на 1 мкг и выше. [c.306]

Получение гена или его фрагмента осуществляют с использованием обратных транскриптаз — ферментов, которые катализируют синтез ДНК на матрице мРНК [c.90]

Одновременное использование двух не термостабильных ДНК-полимераз - Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I и секвеназы -позволило исключить характерные для секвенируемой матрицы стопы [Redston, Кет, 1994]. Независимое секвенирование одной и той же матрицы разными полимеразами (Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы I и обратной транскриптазой) и их последующее одновременное разделение гель-электрофорезом позволило прочитать отдельные трудные участки ДНК, поскольку эти полимеразы формировали стопы в несколько отличающихся местах [Omstein, Kashdan, 1985]. [c.113]

Другую разновидность внутреннего введения метки можно представить как возможность мечения уже самого праймера по его 3 -концу флуоресцеин-15-дАТФ за счет использования 3 —> 5 -экзонуклеазной активности нативной Т7 ДНК-полимеразы, способной в отсутствие остальных дНТФ провести обменную реакцию при условии, что концевой нуклеотид праймера будет тот же дАМФ. Добавление различных флуоресцентных красителей к 3 -концу праймера путем его ферментативного удлинения с помощью дУТФ с пришитыми флуорофорами показало, что ряд ДНК-полимераз (Кленовский фрагмент ДНК-поли-меразы I, обратная транскриптаза и некоторые другие) способны эффективно включать подобные объемные соединения, которые, в свою очередь, не препятствуют дальнейшему синтезу комплементарной цепи ДНК [Александрова и др., 1990]. Упомянутая выше обменная реакция, осуществляемая за счет 3 —> 5 -экзонуклеазной активности нативной Т7 ДНК-полимеразы, приводила, по существу, к образованию флуорес- [c.315]

Смотреть страницы где упоминается термин Обратная транскриптаза использование в ПЦР: [c.447] [c.20] [c.500] [c.503] [c.612] [c.343] [c.343] [c.102] [c.34] [c.26] [c.158] [c.160] [c.224] [c.243] [c.102] [c.255] [c.67] [c.458] [c.86] [c.339] [c.445] [c.88] [c.309] [c.349] [c.194] [c.72] [c.72] [c.270]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология