Амплификация геномной последовательности

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)—это метод амплификации in vitro, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определенную последовательность ДНК в количестве, превышающем исходное в 10 раз [1, 2]. Такая высокая степень направленного обогащения значительно упрощает использование имеющегося образца ДНК-Некоторые области применения ПЦР высокоэффективное клонирование геномных последовательностей [3], прямое секвени-рование митохондриальной и геномной ДНК [5—7, см. ниже], анализ вариаций нуклеотидных последовательностей [8] и выявление вирусных патогенов [9—И]. [c.176]

Амплификация геномной последовательности вручную [c.182]

Во всех известных на сегодняшний день случаях не только геномные копии, но и кДНК любого из этих генов в составе экспрессирующего вектора способны к амплификации в трансфицированных культивируемых клетках (см., например, [6—9,11,12]). Следовательно, вряд ли существует некая специфическая последовательность ДНК, ответственная за амплификацию. И хотя механизм этого явления изучен недостаточно полно, можно все-таки предположить, что в ходе селекции происходит лишь фиксирование определенных случайных событий амплификации, возникающих независимо с определенной частотой во всех пролиферирующих клеточных популяциях. Одна из гипотез связывает эти события с ошибками репликации ДНК [2]. С этой гипотезой согласуется наблюдение о том, что амплифицирующиеся участки хромосомной ДНК во всех случаях значительно превышают по размеру собственно кодирующую последовательность фермента (часто амплифицируются фрагменты длиной более 1000 т. п.н.). Точно так же при селекции на амплификацию клонированных генов увеличивается число копий и других последовательностей вектора — они тоже вовлекаются в амплификацию. [c.240]

ПЦР с аллель-специфическими праймерами является простым и эффективным методом обнаружения мутаций в геномной ДНК обследуемых индивидуумов. В отличие от всех рассмотренных выше методов аллель-специфическая ПЦР в такой постановке позволяет находить небольшое количество мутантных ДНК на фоне большого числа молекул ДНК дикого типа. Аналогичная генетическая ситуация может иметь место в том случае, если соматические мутации возникают в процессе онтогенетического развития организмов, и лишь небольшая часть соматических клеток (клон соматических клеток) таких орга-низмов-мозаиков содержит анализируемые мутации. В этом случае, например, при онкологических заболеваниях, мутантные ДНК в препаратах суммарной ДНК сильно разбавлены соответствующими последовательностями дикого типа и их трудно обнаружить другими методами. Аллель-специфические праймеры, полностью комплементарные лишь мутантным последовательностям анализируемой ДНК, вовлекаются в амплификацию таких мутантных последовательностей, а последовательности нуклеотидов ДНК дикого типа не амплифицируются. Подобный подход позволяет обнаруживать несколько десятков или сотен молекул мутантной ДНК на фоне десятков тысяч молекул ДНК дикого типа. [c.217]

Роль амплификации последовательностей ДНК в эволюции генома. Сходные последовательности в пределах одного генома в принципе могут возникать как независимо, так и при копировании исходной уникальной последовательности ДНК-после-довательности- родоначальника . Вероятность того, что две сходные последовательности возникли независимо, тем меньше, чем больше их сходство и длина. Нет сомнений, что именно увеличение числа предковых последовательностей привело к появлению семейств сходных последовательностей, которые составляют значительную часть современных геномов. Увеличение числа копий сегментов ДНК в ходе эволюции или в процессе эксперимента называется амплификацией. За амплификацию последовательностей в составе кластеров или последовательностей, рассеянных по новым геномным локусам, отвечают разные механизмы (гл. 10). Если основная последовательность удовлетворяет физиологические потребности организма, то образование дополнительных ее копий в геноме не приводит к особым преимуществам- подразумевается, что все эти копии, кроме одной, не содержат мутаций, включая нуклеотидные замены, делеции и вставки. Одна измененная копия может быть нефункциональной или выполнять какие-то новые функции либо служить регуляторным элементом. Если такие измененные последовательности окажутся полезными, то они сохранятся под давлением отбора. В противном случае эти последовательности следует отнести к псевдогенам. Таким образом, амплификация ДНК создает основу для эволюции. [c.159]

Многие геномные перестройки не запрограммированы, они не связаны с каким-то специфическим влиянием на экспрессию генов и в них есть э.темент случайности. Случайными могут быть частота таких событий, сами сегменты ДНК или то и другое. Примерами таких довольно редких событий служит транспозиция последовательностей ДНК из одного геномного локуса в другой или дупликация и последующая амплификация сегментов ДНК. Однако сходные транспозиции и амплификации могут быть сопряжены также с неслучайными, запрограммированными изменениями. Такие запрограммированные события играют ключевую роль в регуляции экспрессии некоторых генов во время дифференцировки и развития определенных типов клеток. [c.227]

Рис. А, А демонстрирует накопление дцДНК и оцДНК в ходе обычной амплификации геномной последовательности, использующей исходное соотношение затравок 50 0,5 пмоль в 100 мкл реакционной смеси. Как и ожидалось, количество дцДНК возрастает экспоненциально до момента практического исчезновения из реакционной смеси одного из праймеров, после чего количество этой ДНК нарастает очень медленно. Фракция оцДНК появляется, начиная с 25-го цикла, с момента, когда запас ли-

Рис. 30. Амплификация последовательностей геномной РНК вируса иммунодефицита человека [311] О(3-репликазой [162]

Если при амплификации геномной ДНК позвоночных в качестве праймеров для ПЦР используют олигонуклеотиды длиной 20 нуклеотидов и более, то процесс этот довольно специфичен и амплифицируется только один фрагмент ДНК- Однако иногда среди продуктов реакции наблюдается накопление фрагментов, происхождение которых трудно объяснить. А поскольку эти фрагменты могут мешать последующему анализу (РНКазному расщеплению, ДГГЭ, секвенированию), то рекомендуется провести еще одну серию амплификаций, с использованием другого набора олигонуклеотидных праймеров. Этот метод, именуемый nested oligo [22], состоит в следующем продукт первичной полимеразной цепной реакции используется в качестве матрицы в последующих раундах ПЦР, но уже с двумя другими олигонуклеотидами, имеющими гомологии с участками ДНК внутри первичного амплифицированного фрагмента (рис. 6, Б). Такая процедура позволяет получить большое количество индивидуальной последовательности ДНК, несколько более короткой, чем исходный фрагмент, и использовать ее для последующего анализа. [c.139]

Использование Qp-репликазы для амплификации нуклеотидных последовательностей. Этот способ амплификации осуществляется на уровне РНК с использованием РНК-репликазы, которая обычно участвует в репликации геномной РНК колифага Q(3 329]. Соответствующие РНК-матрицы могут быть получены субклонированием требуемых последовательностей в виде фрагментов ДНК, внедренных в последовательности Qp-ДНК под контроль промотора Т7-РНК-полимеразы в подходящем векторе. С помощью Т7-РНК-полимеразы на ДНК-матрице такого плазмидного вектора можно получать копии РНК, которые будут служить матрицами при синтезе РНК Qp-репликазой in vitro. При более общем подходе к реализации этих идей получают два РНК-зонда, которые гибридизуются с соседними последовательностями анализируемой РНК таким образом, что между ними остается одноцепочечный разрыв, который может быть ликвидирован с помощью Т4-ДНК-лигазы. Оба зонда по отдельности не могут реплицироваться Qp-репликазой, однако, после ковалентного соединения в составе объединенной молекулы становятся для нее хорошей матрицей (рис. 30). [c.248]

Один из ПЦР-тестов основан на выявлении фрагмента ДНК длиной 188 п. н., который присутствует во множестве копий в геноме Т. ruzi, но отсутствует в геномной ДНК нескольких родственных паразитов. После амплификации этот фрагмент без труда обнаруживается с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Незначительно варьируя методику проведения ПЦР (например, изменяя нуклеотидную последовательность праймеров), последнюю можно использовать для обнаружения широкого спектра бактерий, вирусов и паразитов. [c.190]

Для постановки ПЦР необходимо знать последовательность как минимум 17 пн с обеих сторон исследуемого фрагмента ДНК Обычно синтезируют два дезоксинуклеотида длиной 20-30 оснований, представляющие собой концевые последовательности интересующего нас фрагмента ДНК Используя комплементарные к этим участкам олигомеры — праймеры, запускают амплификацию Избыточные количества праймеров смешивают с геномной ДНК, а затем последовательно осуществляют реакции денатурации, отжига (реассоциации) и наращивания цепи (удлинение праймера) Тепловая денатурация сопровождается расплетением двойной спирали ДНК При снижении температуры имеет место отжиг олигонуклеотидов, то есть происходит гибридизация олигонуклеотидных праймеров со своими комплементарными последовательностями Наращивание цепи праймеров катализируется ДНК-полимеразой [c.204]

Семейства поторяющихся последовательностей как нефункциональные структуры. В разд. 9.4.Г мы уже говорили о том, что некоторые геномные сегменты не выполняют никаких генетических функций. По-видимому, именно таковы псевдогены и процессированные гены. Если учесть, что многие диспергированные семейства содержат большое число таких генов, то можно сделать вывод о нефункционально-сти целых семейств. Такая ДНК получила название эгоистичной, поскольку вся ее деятельность направлена на собственные амплификацию и распространение в геноме. Возможные механизмы амплификации и распространения описаны в гл. 10. Здесь мы лишь отметим, что такие события отнюдь не безобидны распространение повторов в геноме может приводить к инсерционным мутациям в регуляторных или кодирующих последовательностях. Кроме того, множественные диспергированные повторы могут благоприятствовать делециям функциональных сегментов в результате гомологичной рекомбинации. Таким образом, ничем не органиченная эгоистичность может иметь катастрофические последствия для функциональной части генома. [c.206]

Векторы, несущие ген dhfr, имеют то преимущество, что провирусные последовательности можно подвергнуть амплификации путем метотрексатной селекции это позволяет повысить уровень экспрессии и титр вирусных препаратов [21]. Тем пе менее наибольшее распространение в качестве доминантных маркеров получили гены, обеспечивающие селективную лекарственную устойчивость — такие, как neo или hgr. Это объясняется тем, что они хорошо сочетаются со многими клеточными типами и не требуют специальной среды для селекции. Во всех известных конструкциях векторов для спаренных генов ген, расположенный ближе к 5 -LTR, экспрессируется в составе геномного вирусного РНК-транскрипта. Для обеспечения экспрессии более удаленного гена применяют два разных методических приема это либо экспрессия в составе отдельной субгеномной РНК, образующейся в результате сплайсинга вирусной РНК, либо использование внутреннего промотора, введенного в состав вектора. [c.281]

Примерно десятую часть продуктов реакции амплификации исследуйте при помощи электрофореза в агарозном геле. Во многих случаях получается одна полоса, окрашенная бромистым этидием. Можно даже примерно рассчитать количество амплифицированной ДНК- Обычно при амплификации последовательности длиной 1 т. п. н. из 0,3 мкг геномной ДНК млекопитающих получают 1 мкг амплифицированной последовательности. При амплификации маленького фрагмента ДНК последовательно с двумя парами праймеров (внутренних и внешних) можно получить несколько микрограмм такого внутреннего фрагмента. Иногда в геле обнаруживаются дополнительные полосы, происхождение которых неизвестно. Однако они не мешают анализу специфических фрагментов методом РНКазного расщепления или ДГГЭ. При использовании метода nested oligo такие полосы не появляются. [c.144]

Первоначально реакцию гибридизации между меченым РНК-зондом и небольшим количеством комплементарных последовательностей из нескольких микрограмм суммарной геномной ДНК проводили с молярным избытком РНК- Сейчас, когда за счет амплификации ДНК в ПЦР удается получать большие количества специфических фрагментов ДНК, нет необходимости использовать избыток зонда. В описываемых ниже экспериментах используется по существу избыток тестируемой ДНК- Эта модификация позволяет увеличить отношение сигнала к фону, так как в этом случае уже не приходится удалять остатки длинного зонда с помощью РНКазной обработки. [c.150]

Гены всех четырех белков образуют мультигенное семейство, которое, вероятно, произошло от одного предкового гена в результате амплификаций и мутаций как кодирующей, так и регуляторной последовательностей (рис. IV. 1). Имея в распоряжении эти гены, мы можем теперь исследовать механизм, с помощью которого в соседних клетках синтезируется только один из пигментов родопсин в палочках, а чувствительные к красному, зеленому или синему цвету пигменты-в различных колбочках. Клонирование этих генов дает ответ на вопрос и о причине высокой частоты цветовой слепоты у человека. У мужчин, не страдающих дальтонизмом, имеются один ген чувствительного к красному цвету пигмента и разное число (один или три) генов пигмента, чувствительного к зеленому цвету, которые образуют тандем на длинном плече Х-хромосо-мы. Результаты блот-гибридизапии с использованием геномной ДНК мужчин, страдающих разными типами красно-зеленой цветовой слепоты, показывают, что аберрантное цветовосприятие часто бывает связано с мутациями, возникающими при рекомбинациях, сопряженных с неравным кроссинговером [c.341]

Для выявления точковых мутаций, небольших делеций и инсерций в исследуемых генах используется множество различных подходов, основанных на методе ПЦР, благодаря которому можно многократно увеличить уникальную последовательность ДНК, а затем проанализировать её на предмет мутации. С помошью специфических олигонуклеотидных праймеров проводят амплификацию кодирующих участков геномной ДНК в случае, если известна экзон-интронная структура исследуемого гена. [c.265]

Смотреть страницы где упоминается термин Амплификация геномной последовательности: [c.205] [c.182] [c.182] [c.311] [c.194] [c.42] [c.120] [c.120] [c.140] [c.180] [c.140] [c.180] [c.160] [c.218] [c.195] [c.271] [c.303] [c.314] [c.287]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология