Когда ген клонирован

По мере развития методов репродуктивной биологии млекопитающих и создания различных трансгенных животных становилось все более очевидным, что клонирование человека - дело не столь отдаленного будущего. Предположение стало реальностью в 1997 г., когда была клонирована овечка, названная Долли. Для этого использовалось ядро дифференцированной клетки донорной суягной овцы. Методический подход, который использовался при создании Долли, в принципе пригоден для получения клонов любых млекопитающих, в том числе и человека. И даже если он не оправдает себя применительно к млекопитающим других видов, по-видимому, не потребуется слишком много экспериментов, чтобы разработать подходящий метод. В результате клонирование человека тотчас станет предметом любой дискуссии, затрагивающей этические проблемы генетики и биологической медицины. [c.530]

Пример Б. Популяцию гибридных клеток, из которых только часть синтезирует антитела к НВз, клонировали методом лимитирующих разведений. Надосадочную жидкость из индивидуальных культур испытывали с помощью ИфМ и РИМ, используя антигены НВз, сорбированные на поверхности пластика в лунках панелей для микротитрования. Надосадочную жидкость брали на 8-й день культивирования, когда 10—20% клеток начинают сливаться в монослой. Данные рнс. 4 указывают иа то, что результаты обоих методов полностью согласуются. [c.337]

Когда мы клонируем какой-нибудь ген (скажем, ген инсулина человека), мы реплицируем (размножаем) его в бактериальных клетках и, таким образом, производим большое количество инсулин-специфической ДНК. Это говорит о том, что аппарат репликации ДНК бактерий обрабатывает ДНК-последователь-ность человека так же, как и бактериальную. Если мы хотим получить большое количество белка инсулина для лечения диабета, мы экспрессируем клонированный ген человека в бактерии. То есть, мы заставляем бактерию производить человеческий инсулин. И бактерия создает тот же самый инсулин, с той же последовательностью аминокислот, что и клетка человека. Это означает, что генетический код прочитывается одинаково и в бактериальной, и в человеческой клетках, а разошлись они в ходе эволюции, возможно, 3,6 млрд. лет назад. [c.57]

Необходимо отметить, что жизнеспособность вариантов фага Я резко снижается, когда размер их генома составляет более 105 или менее 78 % генома фага дикого типа. Поэтому каждый конкретный векторный фаг имеет ограничения по размеру фрагментов ДНК, которые можно в нем клонировать. Суммарный размер ДНК гибридных фагов должен находиться в интервале 38-51 тпн. [c.100]

Если на первом этапе клонирования использовался метод дробовика , то бактерии, включившие донорную ДНК, совсем не обязательно будут нести фрагмент ДНК с нужным геном. Донорная ДНК представляет собой смесь очень большого числа рестрикционных фрагментов (в случае ДНК человека — до миллиона). Даже в том случае, когда все эти фрагменты клонируются, нужный ген или участок ДНК будет содержать только один из них или несколько. Смесь клонов, полученных таким путем, называется библиотекой. Библиотеку можно также получить, если на первом этапе использовать обратную транскриптазу и смесь мРНК. Иногда это приходится делать, если нужную мРНК нельзя выделить в чистом виде. Таким образом, в тех случаях, когда клонировался не одиночный ген (синтезированный или считанный с мРНК одного типа), после четвертого этапа получают бактериальные культуры в виде библиотек. [c.224]

По-видимому, это был первый случай в истории, когда о начале великой технологической революции возвестил биржевой колокол. В 1980 г., когда фирма Genente h впервые предложила обществу свои акции, это была небольшая компания в Калифорнии, в течение четырех лет успешно работавшая над проблемой получения рекомбинантных ДНК. За два года до этого ученым компании удалось выделить фрагменты гена (последовательности ДНК), кодирующие человеческий инсулин, и перенести их в генетические элементы (клонирующие векторы), способные реплицироваться в клетках обычной кишечной палочки Es heri hia oli). Эти бактериальные клетки работали как биологические фабрики по производству человеческого инсулина, который после соответствующей очистки мог использоваться как лекарственный препарат для больных диабетом, дающих аллергическую реакцию на свиной инсулин. Еще десять лет назад такое развитие событий представ- [c.15]

Процесс биосинтеза одного антибиотика может состоять из 10-30 ферментативных реакций, так что клонирование всех генов его биосинтеза -задача не из легких. Один из подходов к выделению полного набора таких генов основан на трансформации одного или нескольких мутантных штаммов, не способных синтезировать данный антибиотик, банком клонов, созданным из хромосомной ДНК штамма дикого типа. После введения банка клонов в мутантные клетки проводят отбор трансформантов, способных синтезировать антибиотик. Затем выделяют плазмидную ДНК клона, содержагцего функциональный экспрессирующийся ген антибиотика [т. е. ген, восстанавливающий (комгглементиру-ющий) утраченную мутантным штаммом функцию], и используют ее в качестве зонда для скрининга другого банка клонов хромосомной ДНК штамма дикого типа, из которого отбирают клоны, содержащие нуклеотидные последовательности, которые перекрываются с последовательностью зонда. Таким образом идентифицируют, а затем клонируют элементы ДНК, примыкающие к комплементирующей последовательности, и воссоздают полный кластер генов биосинтеза антибиотика. Описанная процедура относится к случаю, когда эти гены сгруппированы в одном сайте хромосомной ДНК. Если же гены биосинтеза разбросаны в виде небольших кластеров по разным сайтам, то нужно иметь по крайней мере по одному мутанту на кластер, чтобы получить клоны ДНК, с помощью которых можно идентифицировать остальные гены кластеров. [c.259]

Клонированы и охарактеризованы гены различных токсинов В. thuringiensis. Один из таких генов был введен в неспорулирующий штамм Ba illus. При этом ген экспрессировался на всех стадиях развития микроорганизма, а не только на стадии образования спор, когда формируется параспоральный кристалл. [c.345]

Адаптер (Adaptor) 1. Синтетический двухцепочечный олигонуклеотид с одним тупым концом и одним липким. После пришивания адагггора тупым концом к ДНК-мишени последнюю можно встраивать в подходящий вектор, используя приобретенный ею липкий конец. 2. Синтетический одноцепочечный олигонуклеотид, у которого после самогибридизации появляются липкие концы и внутренний сайт для рестрицирующей эндонуклеазы. Когда адаптор встраивают в клонирующий вектор, у последнего появляется новый сайт рестрикции. [c.543]

Плазмиды и фаги обеспечивают перенос чужеродной ДНК в качестве инертной части генома, поэтому их называют еще клонирующими векторами В биологической технологии выгодны мультикопийные плазмиды (10-20 на клетку) Если же плазмиды находятся под ослабленным контролем репликации, когда прекращается размножение бактерий, то они (плазмиды) накапливаются числом до 1000 на клетку — в результате больше образуется целевого продукта В отличие от хромосомы репликация плазмиды в пермиссивной клетке может происходить при остановке синтеза белка Вот почему, например, при добавлении левоми-цетина к культуральной жидкости сопровождается заметным возрастанием числа копий плазмиды (увеличение степени клонирования) [c.201]

Второй заслуживающий упоминания прием, используемый в селекции перекрестников, — это метод поликроссов (многократных скрещиваний). Его можно использовать в селекции растений, которые удается клонировать (например, многолетних трав). Успех в применении этого метода зависит от умения определить комбинационную ценность отдельных клонов (т. е. того, какой из них дает в среднем наилучшее потомство при скрещивании с большим числом других клонов). Если мы, например, работаем с кормовой травой, состоящей из 100 клонов, то из каждого клона можно получить около 100 отводков. Затем эти отводки рассаживают в 20 различных местах экспериментального участка (по 5 растений каждого клона в одном месте). Разные клоны распределяют случайно друг по отношению к другу, т. е. без определенного плана. Однако, поскольку клонов много и каждый из них высажен в 20 разных местах, можно ожидать, что каждый клон будет опылен смесью пыльцы всех других клонов. Затем семена со всех растений каждого клона соединяют и смешивают. Когда потомство каж- [c.402]

Получить прямое доказательство того, что активированные рецепторы стероидных гормонов связываются со специфическими генами, было очень трудно, и это удалось сделать лишь в 1983г., когда была разработана технология рекомбинантных ДНК. Она позволила клонировать гены, регулируемые стероидными гормонами, и получать в больших количествах специфические последовательности ДНК Необходимо было еще очистить рецепторные белки, что само по себе является весьма трудоемкой и длительной процедурой. Как только удалось получить рецепторы в очищенном виде, связывающие их последовательности ДНК были картированы in vitro методом футпринтинга (разд. 4.6.6), оказалось, что присоединение рецептора защищает от мягкого расщепления нуклеазами или химическими реагентами фуппу специфических нуклеотидных последовательностей ДНК. Если эти короткие узнаваемые последовательности из гена удалить, то стероидный гормон уже не будет активировать его транскрипцию. Более того, если короткий фрагмент ДНК, который содержит узнаваемую последовательность, слить с другим геном (репортером) и затем перенести в клетку, содержащую рецепторный белок, то соответствующий стероидный гормон будет активировать транскрипцию гена-репортера. Эти эксперименты показывают, что последовательности ДНК, узнаваемые in vitro активированными рецепторами стероидных гормонов, действительно опосредуют действие рецептора в клетке. Гены, чувствительные к стероидным гормонам, как правило, содержат несколько групп узнаваемых последовательностей, обычно расположенных выше (а иногда и ниже ) кодирующей области где-нибудь внутри гена (рис. 12-10). Ввиду значительной структурной гомологии между разнообразными репепторами лля стероидных гормонов близкое сходство распознаваемых ими последовательностей не вызывает удивления. [c.350]

Дрожжи - одноклеточные эукариотические организмы, очень подходящие для генетического анализа. И у почкующихся, и у делящихся дрожжей было идентифицировано множество мутаций, затрагивающих цикл клеточного деления ( d ), и клонированы соответствующие гены дикого типа. У дрожжевых и многих других эукариотических клеток, несмотря на изменчивые условия питания, поддерживаются стандартные размеры клетки с помощью механизма, который препятствует прохождению клетками критической точки (называемой точкой старта) и запускает цикл деления, когда они достигают пороговых размеров. У дрожжей некоторые из ключевых генов d , участвующих в этом контроле, были идентифицированы и их нуклеотидные последовательности определены. Один из них (обозначаемый d 2 у делящихся дрожжей и d 28-y почкующихся дрожжей) кодирует протеинкиназу, гомологичную MPF другой ген ( d 3) кодирует дрожжевой гомолог циклина. [c.414]

Рис. 2 дает представление о размерах хромосомных сегментов, в пределах которых работают различные современные методы генетических исследований. Ось ординат представляет собой логарифмическую шкалу физических расстояний, измеренных в парах (или в тысячах пар) нуклеотидов (п.н. или т.п.н,). На шкале приведены и значения генетических расстояний, измеряемые в сантиморганидах (сМ). 1 сМ приблизительно равна 10 п. н. Однако это соотношение нельзя считать универсальным, ибо зависимость между генетическим и физическим расстоянием на хромосоме имеет нелинейный характер, на нее могут оказывать влияние горячие точки рекомбинации. Наличие таких областей может привести к ситуации, когда сравнительно большому генетическому расстоянию соответствует небольшой отрезок на физической карте. В то же время в геноме существуют участки, рекомбинация в которых маловероятна, а это приводит к обратной ситуации. Как показано на рис. 2, классические методы молекулярной генетики хорошо работают на последовательностях длиной до 50 г. п. н., что соответствует максимальному размеру вставки в космидный вектор. Участки большей длины можно клонировать путем прогулки по хромосоме , когда, используя уже клонированные последовательности, геномную библиотеку скринируют с целью получения перекрывающихся клонов. Таким способом удаётся анализировать последовательности длиной до нескольких сотен т. п. н. Однако, в [c.96]

Клетки, получаемые непосредственно из опухолей, можно клонировать на стекле в виде монослойной культуры. Однако в последнее время появляется все больше данных о клонировании клеток в суспензии, при котором удается избавиться от стро-мальных элементов, которым необходима для роста твердая подложка. Теоретически преимущество клонирования в суспензии состоит в том, что в такой системе эффектам подвержены лишь клетки с высокой способностью к самообновлению (возможно, стволовые клетки опухолей) клетки с низкой пролифе-ративнои активностью, составляющие большую часть опухоли, в формировании ответа не участвуют. Это, однако, справедливо только в том случае, когда колонии представляют собой истинные клоны (то есть возникают из единичной клетки, а не из клеточного агрегата) и подсчет их производится после многих клеточных генераций. В реальных исследованиях эти требова- [c.262]

Перед сменой среды панели с клетками следует просмотреть род микроскопом. Морфология культур оиисана в методике А. Если клетки не повреждаются во в ремя смены среды, то начавшие расти гибридомы должны образовать достаточно обособленные колонии. Если рост колоний наблюдается в большей часги лунок, то необходимо подсчитать число инди-ви дуальных колоний в каждой лунке. Если лунка содержит более одной колонии, то, проводя скрининг, следует, не откладывая, отбирать и клонировать линии гибридных клеток. В целом гибридомы, растущие в панелях ostar, должны быть клонированы как можно раньше, поскольку в данном случае - в отличие от того, когда используют панели для микротитрования) в лунках обраЗ)уется более одной колонии. Полезно руководствоваться следующим соображением если в /з лунок или менее наблюдается рост клеток, то в большинстве случаев в лунках представлен рост клонов. [c.131]

В качестве альтернативы описанному выше подходу или дополнения к нему, для размножения клеток, образующих антитела, и доведения культуры до состояния моноклональности можно использовать простые методы клонирования. Одни исследователи проводят клонирование на как можно более ранних стадиях культивирования, т. е. непосредственно после заражения клеток ВЭБ [11]. Другие дают ВЭБ-зараженным клеткам подрасти и затем клонируют их [12]. Преимущество клонирования заключается в том, что культивируемая линия клеток, образующих антитела, с самого начала становится моноклональной. Непреодолимый недостаток клонирования, особенно в тех случаях, когда не применяется обогащение кле- [c.160]

Напомним, что когда число клеток (бластомер) эмбриона не превышает восьми, они еще тотипотентны (не дифференцированы) и каждая из них может дать начало новому организму. Это позволяет проводить искусственное разделение 4—8-клеточных эмбрионов на отдельные клетки, культивировать их in vitro до стадии бластоцисты и имплантировать в матку псевдобеременных животных-реципиентов ( приемных матерей). Таким путем можно клонировать животных, т. е. получать генотипически одинаковые особи (однояйцевых близнецов). [c.148]

Полипептидные факторы транскрипции. Большое число факторов, предположительно участвующих в транскрипции ранней области SV40. было выделено из клеточных экстрактов, способных осуществлять транскрипцию с промотора ранней области. Для их идентификации, очистки и изучения применялись разные методы. Некоторые факторы специфически связываются с конкретным элементом, о чем свидетельствует их способность защищать определенные основания в этом элементе от расщепления ДНКазой 1 (футпринтинг разд. 8.2.в), а также уменьшение электрофоретической подвижности ДНК, содержащих такой элемент, при связывании его с белком (смещение полосы). Имеются данные о восстановлении транскрипционной активности в экстрактах, обедненных определенными факторами, при добавлении последних, а также об отсутствии такого восстановления в том случае, когда сайты связывания разрушены. Это указывает на то, что связывание данных факторов активирует транскрипцию. Клонированы и секвенированы гены, кодирующие некоторые факторы транскрипции. Их экспрессия в Е. соН и способность синтезированных продуктов активировать транскрипцию in vitro позволяют идентифицировать важные домены белков. [c.54]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология