Градиентный электрофорез

Рис. 9. Гели для оптимизации продолжительности электрофореза (оптимизирующие гели). На каждом рисунке показаны результаты, полученные в параллельно-градиентных денатурирующих гелях с нанесением образцов через определенные промежутки времени. Такие оптимизирующие гели дают представление об оптимальной продолжительности электрофореза, проводимого с целью максимального разделения мутантного фрагмента ДНК и фрагмента ДНК дикого типа. А. Оптимизирующий гель с фрагментом ДНК, не претерпевшим заметных изменений подвижности по достижении участка с концентрацией денатурирующего вещества, соответствующей температуре плавления первого домена. Расстояние между вершиной и основанием геля измерено линейкой. Полученная информация используется для определения участка геля, соответствующего Гт первого домена плавления. Это значение в свою очередь было предварительно установлено в перпендикулярно-градиентном электрофорезе. Промежуток времени, за который фрагмент достигнет данного участка, считается минимальной продолжительностью проведения последующих электрофорезов. Обычно для получения оптимальных результатов к этому времени прибавляют еще 1—2 ч. Б. Оптимизирующий гель с фрагментом ДНК, резко изменившим подвижность при плавлении первого домена. Электрофорез в течение 12 ч (лунка 1), 10 ч (лунка 2), 8 ч (лунка 3), 6 ч (лунка 4), 4 ч (лунка 5) и 2 ч (лунка 6). Через восемь часов прохождения через гель, когда начинается процесс плавления, фрагмент замедляет движение. Оптимальное время для последующих электрофорезов этого фрагмента — 9— 10 ч. В. Оптимизирующий гель с мутантными фрагментами и фрагментами дикого типа. Если имеется известный мутантный фрагмент, то гели такого типа можно использовать для эмпирического определения оптимального времени электрофореза. Это время, за которое достигается максимальное разделение утан иого фрагмента и рагмента дикого типа.

При двумерном разделении белков и пептидов возможны различные комбинации методов электрофорез с градиентным гелем и изоэлектрической фокусировкой [212], гель-фильтрация с изоэлектрической фокусировкой [213], гель-фильтрация с электрофорезом [214], двумерный электрофорез с различными буферными системами [215—218], двумерная хроматография с различными растворителями [219—221] и хроматография в сочетании с электрофорезом или изоэлектрической фокусировкой. Райт и др. [222] оценивали результаты одно- и двумерного разделения сложных смесей белков, подсчитывая число разделенных полос, и установили, что двумерный электрофорез на геле акриламида дает большее число полос, чем периодический или непрерывный градиентный электрофорез на геле акриламида, изоэлектрическая фокусировка или изоэлектрическая фокусировка, сопровождаемая непрерывным градиентным электрофорезом на геле. [c.518]

Профиль плавления фрагмента ДНК определяется электрофорезом в перпендикулярно-градиентном геле. Подобранные условия воспроизводят затем на параллельно-градиентных гелях. Наряду с этим следует проводить эксперименты по выявлению оптимального времени проведения параллельно-градиентного электрофореза. Цель таких опытов — установить продолжительность электрофореза, достаточную для того, чтобы фрагмент ДНК достиг участка геля, в котором концентрация денатурирующего вещества вызывает плавление исследуемого в дан- [c.163]

Перпендикулярно-градиентный электрофорез определение характера плавления [c.160]

Существуют различные методы определения характера плавления фрагмента ДНК в растворе. Зная нуклеотидную последовательность фрагмента, с помощью компьютерного алгоритма Лермана [18, 19, 38, 39] можно предсказать количество, локализацию и Тт его доменов плавления. А эти данные, в свою очередь, позволяют подобрать оптимальные градиент и время для наилучшего разделения мутантных фрагментов в геле. Наряду с компьютерным анализом, который является эффективным и надежным средством определения характера плавления, можно использовать эмпирический подход. В его основе лежит денатурирующий перпендикулярно-градиентный электрофорез в вертикальном геле. Этот метод особенно важен при исследовании неизвестных фрагментов ДНК на полиморфизм и в ряде других случаев, когда неизвестна его нуклеотид-лая последовательность. [c.160]

Для проведения перпендикулярно-градиентного электрофореза выполните следующие процедуры. [c.162]

Примечание для предварительных градиентных электрофорезов, проводимых с целью оптимизации условий, нет необходимости отделять вставку (тестируемый фрагмент) от векторной последовательности. Размеры вектора и вставки сильно различаются, и поэтому скорости продвижения их в геле неодинаковы. Обычно векторные последовательности из-за своего большого размера едва успевают войти в гель. [c.162]

Гели для параллельно-градиентного электрофореза готовят так же, как гели с перпендикулярным градиентом, и электрофорез проводят аналогичным образом. По бокам от вершины к основанию вставляют два боковых спейсера точно так же, как в сиквенсных гелях или гелях для анализа белков. После закрепления в аппарате для электрофореза боковые стороны и основание пластин заливают, как обычно, агарозой. Раствор заливают так же, как при обычном вертикальном форезе, только, не сбоку, а сверху. После заливки вставляют дельриновую или тефлоновую гребенку и оставляют гель полимеризоваться. Иа заполимеризовавшегося геля вынимают гребенку и помещают установку в ванну с нагретым буфером. Все необходимое снаряжение подсоединяется, как при обычном вертикальном электрофорезе. [c.159]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология