Изоэлектрическая фокусировка

Наиболее широкое применение нашел метод изоэлектрической фокусировки. Он основан на создании под действием внешнего электрического поля стабильного градиента pH, причем значение pH возрастает от анода к катоду. В такой системе каждый белок перемещает в том или ином направлении в соответствии со знаком своего заряда до тех пор, пока не достигнет участка, в котором значение pH совпадает с его изоэлектрической точкой. На этом участке дальнейшее его перемещение под действием электрического поля прекращается, так как его заряд становится равным нулю. Приложенное поле, поддерживающее стабильный градиент pH, препятствует также диффузному размыванию зоны. Механизм аналогичен только что рассмотренному эффекту градиента плотности раствора сахарозы на стабилизацию зон при седиментации. Действительно, если в результате диффузии белок уходит из участка, на котором pH = р1, в сторону катода, он попадает в область более высоких значений pH и заряжается отрицательно. Под [c.243]

Белки являются амфолитами, т. е. они содержат как положительно, так и отрицательно заряженные группы. Для всех амфолитов характерна зависимость их заряда от pH при низких pH они заряжены положительно, а при высоких — отрицательно. Для каждого амфолита существует такое значение pH, при котором он является незаряженным это значение называется изоэлектрической точкой. В изоэлектрической точке амфолит не движется в электрическом поле. В градиенте pH молекулы белка будут перемещаться до тех пор, пока не достигнут точки градиента, где они становятся незаряженными после этого они перестают двигаться. В случае смеси белков каждый белок будет перемещаться до точки градиента pH, соответствующей его собственной изоэлектрической точке. Такой метод разделения белков, основанный на различиях изоэлектрических точек в градиенте pH, называется изоэлектрической фокусировкой и является электрофоретическим аналогом центрифугирования с достижением равновесия в градиенте плотности (гл. 11). Процесс движения двух различных белков с отличающимися изоэлектрическими точками схематически показан на рис. 9-15. [c.239]

Изоэлектрическая фокусировка (ИЭФ) в капиллярах [c.105]

Изоэлектрическая фокусировка (ИЭФ) Изоэлектрические точки компонентов [c.349]

Разделение методом электрофореза и изоэлектрической фокусировки [c.514]

Изоэлектрическая фокусировка Белки, пептиды, гликопротеины, моноклональные антитела определение изоэлектрической точки [c.364]

Многие белки и другие амфолиты, которые ранее считались гомогенными, при исследовании методом изоэлектрической фокусировки оказались гетерогенными. Это объясняется тем, что данным методом можно добиться разделения, не осуществимого другими способами. В частности, можно разделить соединения, р/ которых разнятся всего на 0,005 ед. pH [376]. Это возможно потому, что в то время, как при электрофорезе полосы постепенно размываются, в процессе изоэлектрического разделения полосы, наоборот, сужаются. По этой же причине рассматриваемым методом можно обнаружить малые примеси (до 0,2 % [c.171]

Устройство для изоэлектрической фокусировки. [c.241]

Поэтому изоэлектрическая фокусировка — ценный метод окончательной очистки веществ. [c.171]

Тонкослойную изоэлектрическую фокусировку можно проводить на установках для тонкослойного электрофореза, как вертикальных [323—326, 378, 379], так и горизонтальных [327— 328, 380, 384]. [c.171]

Тонкослойная изоэлектрическая фокусировка дает очень хорошие результаты при разделении сложных смесей и при сравнительном исследовании серии проб в одних и тех же условиях. [c.176]

Обычно большинство ферментов в процессе изоэлектрической фокусировки не теряют своей активности, исключение составляют лишь некоторые металлсодержащие ферменты. Их активность часто можно регенерировать, если добавить соответствующий ион металла в исследуемую смесь [413]. При обнаружении ферментов методами, применяемыми в гель-электро-форезе, может потребоваться добавка соответствующего буфера, чтобы нейтрализовать влияние амфолитов. [c.176]

Поскольку в методах изоэлектрической фокусировки и электрофореза разделение идет под действием разных факто- [c.176]

Другой тип двумерного разделения с применением изоэлектрической фокусировки — это метод, в котором используется иммунодиффузия. В этом методе разделение проводят изоэлектрической фокусировкой на полиакриламидном геле, а затем фрагмент геля вводят в агарозу, содержащую антисыворотку. После этого проводят электрофорез в направлении, перпендикулярном первому разделению. Белки перемещаются в агарозу, и в ней появляются зоны миграции антигенов-антител [419]. [c.177]

При двумерном разделении белков и пептидов возможны различные комбинации методов электрофорез с градиентным гелем и изоэлектрической фокусировкой [212], гель-фильтрация с изоэлектрической фокусировкой [213], гель-фильтрация с электрофорезом [214], двумерный электрофорез с различными буферными системами [215—218], двумерная хроматография с различными растворителями [219—221] и хроматография в сочетании с электрофорезом или изоэлектрической фокусировкой. Райт и др. [222] оценивали результаты одно- и двумерного разделения сложных смесей белков, подсчитывая число разделенных полос, и установили, что двумерный электрофорез на геле акриламида дает большее число полос, чем периодический или непрерывный градиентный электрофорез на геле акриламида, изоэлектрическая фокусировка или изоэлектрическая фокусировка, сопровождаемая непрерывным градиентным электрофорезом на геле. [c.518]

Наряду с КЗЭ, при котором удается осуществить разделение только за счет разницы в подвижности, и который в настоящее время представляет собой наиболее распространенный метод, выделяют также капиллярный гель электрофорез (КГЭ) с капилляром, заполненным гелем. При этом на электрофоретическую миграцию молекул оказывает влияние матрица геля, и поэтому достигается селективное разделение молекул по размерам. Незаряженные молекулы можно разделять с помощью мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ). В данном случае к буферу добавляется детергент, и нейтральные молекулы распределяются между буфером и мицеллами в соответствии с их гидрофобностью. Разделение основано на подвижности мицелл, заряженных в большинстве случаев отрицательно. Поскольку в основе разделения лежит процесс распределения, можно с полным основанием говорить о хроматографическом методе. При изоэлектрической фокусировке (ИЭФ) происходит разделение в градиенте pH, формируемом добавлением амфолита к буферу в электрическом поле. Небольшое распространение получила пока электрохроматография (ЭХ), при которой применяется стационарная среда ВЭЖХ, а течение эдюента и перенос пробы происходит только за счет электроосмотического потока. В качестве самой старой капиллярной техники следует упомянуть изотахофорез (ИТФ), который в настоящее время вновь приобрел значение для концентрирования проб в КЭ. [c.7]

Изоэлектрическая фокусировка - электрофорез на слое с градиентом рн. Амфолиты перемещаются по тонкому слою до тех пор, пока не достигнут такого места, где величина pH равна их изоэлектриче-ской точке в этом месте они концентрируются в виде резко очерчен- [c.101]

В 1912 г. Икеда и Судзуки [372] первыми выделили глутаминовую кислоту методом электролиза, однако принципы, на которых основан метод изоэлектрической фокусировки, впервые сформулировали Уильямс и Уотермен [373]. Метод приобрел практическое значение после опубликования работ Вестер-берга и Свенсона [374, 375], в которых впервые были описаны амфолиты, пригодные для получения градиента pH. [c.170]

Для изоэлектрической фокусировки особенно широко используются полиакриламидные гели, обладающие малым электроэндоосмосом. Конерт и сотр. [389] и Лорнинг [390] рекомендуют для улучшения профиля разделения готовить гель из предварительно очищенных реактивов. Эти авторы предварительно проводили двукратную перекристаллизацию акриламида и М,М -метилен-быс-акриламида соответственно из ацетона и хлороформа. [c.172]

Одно из преимуществ тонкослойной изоэлектрической фокусировки — малый расход амфолитов-носителей. Это очень важное преимущество, так как поставляемый фирмами амфо-лит (амфолин) очень дорог. Он представляет собой синтетическую смесь низкомолекулярных полиаминокарбоновых кислот неизвестного состава. [c.173]

Концентрация амфолита-носителя имеет большое значение. Конерт и сотр. [389] исследовали некоторые факторы, влияющие на изоэлектрическую фокусировку. При содержании амфолитов порядка 1 % получить стабильный линейный градиент pH не удавалось и приходилось увеличивать концентрацию до 2 %. Эти авторы нашли также, что получить равномерный градиент pH можно, заменив гидроксид натрия и серную кислоту на аноде на 1 % -ную фосфорную кислоту, а на катоде — на 1 %-ный раствор этилендиамина. Применение более высоких концентраций амфолитов не улучшало разделение, а лишь уменьшало скорости перемещения белков. [c.174]

Не следует проводить процесс изоэлектрической фокусировки слишком долго, так как в этом случае градиент pH по слою постепенно сглаживается [387]. Это явление известно как эффект плато . Сглаживание градиента происходит довольно медленно. Вестерберг [409] предложил два способа устранения эффекта плато . Один из них заключается в том, что ам-фолиты-носители добавляют после полимеризации геля. В другом способе гемоглобин или другой хорошо заметный белок наносят на пластинку в двух местах — возле анода и возле катода. В тот момент, когда эти две полосы соединяются, данный [c.175]

Изоэлектрическую фокусировку успешно применяли в микроанализе на слоях размером 8,2X8,2 или 9X9 см [399], а также на предметных стеклах размером 7,5X2,5 мм [403 В этом плане могут представлять интерес методы микроэлектрофореза, описанные Даамсом [316]. [c.176]

Существует несколько методик обнаружения полос белков, разделенных методом изоэлектрической фокусировки. Однако при применении некоторых детектирующих реактивов необходимо перед опрыскиванием пластинки удалить из геля амфолиты-носители. Для этой цели Боур [399] промывал гели 6— [c.178]

Ригетти и Драйсдейл [376] опубликовали обзор работ по изоэлектрической фокусировке на гелях. Кроме того, этой теме посвящена монография [427а], охватывающая ряд работ по тонкослойному разделению. [c.179]

Ригетти и Дрисдейл [103] исследовали возможность разделения нуклеотидов методом изоэлектрической фокусировки на полиамиде. Катон и Гольдштейн [104] провели электрофоретическое разделение РНК на геле полиакриламида с линейным градиентом от 2,5 до 12 % На одном и том же геле можно разделить с хорошим разрешением все РНК от 4S до 28S. Джеппезен [105] использовал линейные градиенты от 3,5 до 7,5 % и от 2,5 до 7,5 % для разделения фрагментов ДНК. Полученные полосы были более четкими, чем при обычном электрофорезе на слоях геля. [c.136]

Градиент pH используется не только в диск-электрофорезе, но и при электрофорезе с достижением изоэлектрической точки. (Изоэлектрическая точка — значение pH, при котором амфолит (молекулы, содержащие катионные и анионные группы, например, белок) теряет заряд и в электрическом поле не движется.) Если смесь белков разделять электрофоретически в градиенте pH, то каждый белок будет двигаться до достижения своей изоэлектрической точки. В результате отдельные белки как бы сфокусированы в отдельных зонах. Поэтому этот метод еще носит название изоэлектрической фокусировки. Он используется не только в аналитических, но и в препаративных целях. Особенно часто он применяется на первых этапах очистки белков, так как позволяет быстро и с высоким разрешением фракционировать довольно большие (граммы) количества образца. [c.114]

Фермент УФ-эндо с помощью различных хроматографических процедур был очищен до несомненной гомогенности. Однако при проверке его методом изоэлектрической фокусировки оказалось, что он состоит из двух белков, каждый из которых обладает ферментативной активностью. Активность фермента определяли по его способности связывать облученную ультрафиолетовыми лучами Н-ДНК с нитроцеллюлозой в мембранном фильтре. Обратите внимание что градиент pH нелинеен. (Любезно предоставил Шейх Рназуддин) [c.242]

Зональный электрофорез 225 Непрерывный (поточный) элщ рофорез 238 Изоэлектрическая фокусировка (23 [c.577]

Модификацией метода электрофореза является изоэлектрическая фокусировка или электрофокусировка. В этом методе раствор, насыщающий гель, содержит соединение с ьсислотно-основными группами. Под влиянием электрического поля кислотно-основные группы буферного соединения меняют степень ионизации, создавая тем самым градиент pH в направлении электрического поля. Электрически заряженные компоненты разделяемой смеси, нанесенной на гель, мигрируют по направлению к электроду противоположного знака. Поскольку эти компоненты передвигаются по градиенту pH, то они постепенно теряют свои заряды и в зоне, где pH соответствует изоэлектрической точке (точке электронейтральности), их движение прекращается. Каждый компонент концентрируется (фокусируется) в определенной области геля. [c.73]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология